張曉飐 宋銳鋒 李芙蕾

慢性乙型肝炎病毒學(xué)發(fā)病機(jī)制主要是乙型肝炎病毒(HBV)感染，而HBV屬不完全環(huán)狀雙鏈DNA病毒范疇，細(xì)胞毒性并不明顯，可誘發(fā)急或慢性肝炎發(fā)生[1]。其中外周血單個核細(xì)胞干擾素刺激基因(Stimulator of interferon gene，STING)基于雙鏈DNA刺激下，其介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素6等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮抗細(xì)菌及病毒作用，并且其自身可直接作為模式識別受體，引發(fā)IFN反應(yīng)。近幾年，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)STING蛋白水平高低與天然免疫反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)[2]?；诖?，本文主要圍繞外周血單個核細(xì)胞STING表達(dá)水平以及HBV復(fù)制兩者的相關(guān)性進(jìn)行分析，為臨床HBV感染治療提供參考依據(jù)，報(bào)道如下。

資料與方法

一、 一般資料

納入2016年12月至2018年12月于我院收治的68例慢性乙型肝炎患者及同期54例健康體檢者，研究對象均知情，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合慢性乙型肝炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，均經(jīng)肝穿刺組織等檢查確診，乙肝表面抗原陽性≥6個月；乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸≥2 000 IU/mL；血清總膽紅素≥171 μmol/L，國際標(biāo)準(zhǔn)化比率≥1.5(凝血酶原活動度≤40%)；年齡>18歲；(2)正常對照組：年齡>18歲；身體健康，肝腎功能等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)均正常，精神行為正常；自身免疫性疾病診斷標(biāo)志物呈陰性；乙肝表面抗原呈陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴心、肺、腦等嚴(yán)重原發(fā)疾?。?2)合并肝癌等惡性腫瘤；(3)合并肝硬化及酒精性、藥物性、遺傳代謝性、自身免疫性肝??；(4)伴甲、丙、戊型等其他肝炎病毒感染；(5)入組前半年內(nèi)接受抗病毒、肝移植等干預(yù)；(6)伴非嗜肝病毒感染引起的肝組織炎癥；(7)精神疾患；(8)孕婦及哺乳期婦女。觀察組68例患者中，男45例，女23例，年齡18～75(53.78±9.56)歲；正常對照組中男34例，女20例，年齡20～78(54.12±9.71)歲。兩組性別、年齡一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本試驗(yàn)經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

二、方法

(一)主要儀器及試劑 主要儀器包括2720型聚合酶鏈反應(yīng)PCR基因擴(kuò)增儀(美國ABI公司)、ViiATM7型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)儀(美國Life Technologies公司)、Q300高精度紫外分光光度計(jì)(美國Quawell公司)、Fluor Chem FC2凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha公司)，其他儀器如臺式高速離心機(jī)、電子天平等均購自德國Eppendorf公司。主要試劑包括9mL二胺四乙酸抗凝真空采血管(美國Becton Dickinson公司)、Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)、SYBR Premix Ex TaqⅡ(日本TaKaRa Bio株式會社)、Thermo Scientific反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)、HBV DNA病毒載量檢測試劑(凱杰生物工程有限公司)。

(二)引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參考美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站提供的STING mRNA序列(確保PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線顯示單峰，預(yù)期設(shè)計(jì)長度與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果提示的目的基因片段長度一致，且目的條帶單一清晰，則示引物特異性較好)，見表1。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)

(三) mRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄 收集空腹靜脈血2 mL，置入二胺四乙酸抗凝真空采血管中，參考淋巴細(xì)胞分離液說明書，行外周血單個核細(xì)胞分離。采用Trizol法提取單個核細(xì)胞總mRNA，行RNeasy Mini Kit純化。采用Q300高精度紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和A260/A280吸光度比值(確保在1.8～20.0之間)。逆轉(zhuǎn)錄時，取RNA模板1 μL，將oligo引物1 μL加入其中，混勻后離心，65℃ 5 min，于冰上加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(Mix 2 μL，Reaction Buffer 4 μL，RT、RI各1 μL)。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，72℃ 10 min，4℃保存。cDNA產(chǎn)物獲取后置-20℃條件下保存。

(四)STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA檢測 RT-PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，上、下游引物均1 μL，cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，ddH2O 7.6 μL，ROXⅡ 0.4 μL。GAPDH、STING、IFN-α、IFN-β、內(nèi)參基因擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)置相同，如下：30s 94℃下預(yù)變性，后20s內(nèi)在94℃下變性，60℃變性20 s，72℃延伸35 s，PCR循環(huán)50個。同時，于60～95℃時行溶解曲線分析。以相對表達(dá)量△Ct比較所有基因mRNA表達(dá)，△Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參。進(jìn)行擴(kuò)增效率驗(yàn)證，GAPDH、STING、IFN-α、IFN-β基因10倍稀釋(梯度5個)，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相差<5%，處于98%～102%間，擴(kuò)增效率類似。

三、觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)兩組IFN-α mRNA、STING mRNA以及IFN-β mRNA 的相對表達(dá)量，分析不同乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)載量與STING及干擾素基因相對表達(dá)量的相關(guān)性。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、 兩組STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相對表達(dá)量比較

觀察組STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相對表達(dá)量顯著高于正常對照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組STING mRNA、IFN-α mRNA、

二、HBV DNA載量與STING及干擾素基因相對表達(dá)量的關(guān)系

按HBV DNA不同載量分為≤104IU/mL組(19例)、104IU/mL～組(18例)、105IU/mL組(14例)、>106IU/mL組(17例)。HBV DNA載量>106組、105組、104組STING mRNA相對表達(dá)量均顯著高于HBV DNA載量≤104組(P<0.05)，見表3。

表3 慢性乙型肝炎患者不同HBV DNA載量與STING及干擾素基因相對表達(dá)量的關(guān)系(±s)

注：與>106組比較，①P<0.05；與105～組比較，②P<0.05；與104～組比較，③P<0.05

三、慢性乙型肝炎患者STING mRNA與HBV DNA載量及干擾素基因相對表達(dá)量的相關(guān)性

經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，慢性乙型肝炎患者STING mRNA相對表達(dá)量與HBV DNA載量呈弱相關(guān)性(r=0.340，P=0.000)，與IFN-α mRNA、IFN-β mRNA相對表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.517、0.511，P=0.000、0.000)，見圖1～3。

圖1 STING mRNA與HBV DNA載量線性相關(guān)圖

圖2 STING mRNA與IFN-α mRNA線性相關(guān)圖

圖3 STING mRNA與IFN-β mRNA的線性相關(guān)圖

討 論

細(xì)胞質(zhì)DNA屬重要免疫刺激物質(zhì)，多源自病原微生物侵入人體后復(fù)制所致外源性DNA及機(jī)體組織、細(xì)胞受損后所致內(nèi)源性DNA，可誘導(dǎo)機(jī)體天然免疫反應(yīng)被激活，形成大量IFN及其他細(xì)胞因子。IFN主要包括兩種亞型，即IFN-α、IFN-β，前者主要源于白細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞)中，后者起源于成纖維細(xì)胞。STING屬DNA傳感器環(huán)鳥苷-腺苷酸合成酶和RNA傳感器人視黃酸誘導(dǎo)基因下游細(xì)胞信號級聯(lián)中銜接蛋白，其介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路可識別多種入侵病毒[4-6]。其中，HBV病毒基因組屬部分雙鏈環(huán)狀DNA，宿主體內(nèi)可演變?yōu)槌菪h(huán)狀、閉合、共價DNA分子，可作為模板轉(zhuǎn)錄出前基因組RNA及其他mRNA，被認(rèn)為是隱形病毒。

本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相對表達(dá)量明顯高于正常對照組，且慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV DNA載量越高，其STING mRNA相對表達(dá)量也明顯增多，這與Pépin G[7]等報(bào)道結(jié)論一致，證實(shí)體外或體內(nèi)STING過度表達(dá)均可抑制HBV復(fù)制，且除固有免疫反應(yīng)外，STING調(diào)節(jié)機(jī)體對HBV的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。另外，本研究結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎患者STING mRNA相對表達(dá)量與HBV DNA載量呈弱相關(guān)性，與IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相對表達(dá)量均呈正相關(guān)。Hua X[9]等也認(rèn)為激活cGAS-STING通路，可抑制HBV復(fù)制。cGAS屬細(xì)胞質(zhì)dsDNA感受器，與細(xì)胞質(zhì)中DNA結(jié)合，催化作用下產(chǎn)生cGAMP；而cGAMP可誘導(dǎo)STING激活，導(dǎo)致下游IFN生成及抗病毒效應(yīng)被激活?？紤]到HBV復(fù)制期間可形成d3DNA、ssDNA，故筆者推測STING參與識別HBV復(fù)制中間體及HBV清除調(diào)節(jié)過程，其過度活化會破壞機(jī)體免疫耐受，誘發(fā)慢性乙型肝炎。

綜上，慢性乙型肝炎患者機(jī)體內(nèi)STING相對表達(dá)量明顯升高，且STING過度表達(dá)干擾HBV復(fù)制，證實(shí)慢性乙型肝炎患者機(jī)體抗HBV免疫應(yīng)答中STING起著重要作用，臨床應(yīng)引起足夠重視。但本研究中由于樣本量偏小，STING抗HBV感染具體機(jī)制有待今后進(jìn)一步深入研究。