李勇勝，藺永和，楊 琴，劉 權(quán)

（蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

紅三葉(Trifolium pratense)，又名紅車軸草、紅花苜蓿等，是一種分布范圍廣的優(yōu)良豆科牧草[1]。紅三葉中含有大量異黃酮類化合物[2]，具有良好的抗氧化、清除自由基活性，可用作治療百日咳、哮喘、濕疹、眼部疾病、癌癥、鎮(zhèn)痙、祛痰、止痛[3]等病癥，常作為功能食品或膳食補(bǔ)充劑[4-5]。作為少數(shù)幾種富含植物雌激素的植物，越來越多地應(yīng)用于臨床中改善和治療婦女更年期綜合癥，以及預(yù)防骨質(zhì)疏松、乳腺癌、心血管系統(tǒng)疾病等。由于植物藥毒性低、靶點(diǎn)多、不易產(chǎn)生抗藥性等眾多優(yōu)點(diǎn)，紅三葉提取物已被制成多種劑型，其銷量在美國多年來一直名列植物藥的前10位[6]。此外，紅三葉異黃酮對其他植物生長具有明顯的抑制作用，是該植物抗逆和種群競爭的物質(zhì)基礎(chǔ)[7-8]，具有重要的生態(tài)功能。

異黃酮含量是紅三葉育種、種植管理及提取和純化工藝優(yōu)化等過程的重要指標(biāo)。目前測定方法主要為紫外分光光度法和高效液相色譜法[9-11]。兩種方法都是利用異黃酮化合物紫外吸收的原理，但測定方法差別較大，適用范圍不盡相同。高效液相色譜法精確度高，可以測定單個異黃酮化合物的含量，但需要標(biāo)準(zhǔn)品較多，操作繁雜，耗時長，測試成本高，多用于異黃酮單個組分的精確分析[9,12-13]。用高效液相色譜法也可以測定紅三葉異黃酮的總含量，但往往只是其中部分異黃酮成分含量的總和，存在較大的系統(tǒng)誤差。生產(chǎn)實(shí)踐中，常常需要對紅三葉異黃酮總量進(jìn)行定量。目前已經(jīng)報道的紅三葉異黃酮有40多種[14]，仍存在一些未知的組分。紫外分光光度法對標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量要求較低，一般1～2個就可以，速度快，靈敏度高，測試成本低，特別適合大量樣品定量、半定量的測定，在異黃酮的研發(fā)中有大量應(yīng)用[14-17]。對于紫外分光光度法而言，影響其測定精度的主要因素有測定波長、溶劑以及標(biāo)準(zhǔn)品的選擇[15]。為了不斷提高紅三葉異黃酮含量測定精度，很多學(xué)者開展了大量的研究工作：陳寒青和金征宇[16]建立了三波長紫外分光光度法，張曉松等[15]采用等吸光點(diǎn)紫外分光光度法。然而這些方法都需要建立在標(biāo)準(zhǔn)品的科學(xué)選擇上，標(biāo)準(zhǔn)品的選擇同時也會改變測定波長等其他因素。

圖1 紅三葉中4種主要異黃酮成分Figure 1 Four isoflavone compounds in red clover

紅三葉異黃酮中含量較高的主要是芒柄花素(formononetin，以下簡稱F)、鷹嘴豆素A (biochanin A，以下簡稱B)、染料木素(genistein，以下簡稱G)和大豆苷元(daidzein，以下簡稱D) 4種異黃酮成分[9-14](圖1)。目前，利用紫外分光光度法對紅三葉中異黃酮的含量進(jìn)行標(biāo)定和檢測中多采用1種標(biāo)準(zhǔn)品，以鷹嘴豆芽素A[11,16,18-23]、芒柄花素[14,24-26]、大豆苷元[27-28]或染料木素作為標(biāo)準(zhǔn)品[29]。有少數(shù)研究采用2種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定，例如用芒柄花素和鷹嘴豆素A組合[15]，用大豆苷元和染料木素組合作為標(biāo)準(zhǔn)品[30]。還有學(xué)者用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定[6]。但是關(guān)于紅三葉異黃酮含量測定的標(biāo)準(zhǔn)品如何選擇及所帶來的誤差鮮見報道。因此，本研究將4種異黃酮成分作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別在240、249、254、260和275 nm對紅三葉材料進(jìn)行測定，并分析測定結(jié)果，以期為建立更準(zhǔn)確的紅三葉異黃酮檢測方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：2017年7月初采自甘肅省岷縣種植的紅三葉的地上部分，分別命名為樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。

試劑：鷹嘴豆素A標(biāo)準(zhǔn)品(含量 ≥ 98%)、芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品 (含量 ≥ 98%)、染料木素 (含量 ≥ 98%)、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品(含量 ≥ 98%)、甲醇(色譜級)均購于北京伊諾凱科技有限公司。

設(shè)備：UV-1600型紫外可見分光光度計(日本島津)。

1.2 方法

1.2.1 紅三葉樣品待測液的制備

稱取植物樣品0.20 g，加入8 mL甲醇，超聲提取30 min。提取液4 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，通過0.45 μm有機(jī)膜過濾，制備待測液。將樣品I～V每個樣品重復(fù)提取3次。

1.2.2 紫外吸收分光光度法

分別準(zhǔn)確稱取芒柄花素、鷹嘴豆素A、染料木素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，然后依次稀釋，得到一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后在波長為190～600 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。芒柄花素和大豆苷元在249 nm處有最大吸收，染料木素在259 nm處有最大吸收，鷹嘴豆素A和紅三葉樣品待測液的最大吸收值在261 nm (圖2)。本研究分別選擇240、249、254、260和275 nm作為測定波長。

以甲醇為空白對照，分別于240、249、254、260和275 nm波長處測定吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算線性回歸方程，計算紅三葉異黃酮含量。

鷹嘴豆素A：Y240= 59.902X+ 0.204 2 (R2= 0.998 2)；Y249= 92.871X+ 0.205 5 (R2= 0.999 3)；Y254= 118.17X+0.205 4 (R2= 0.999 7)；Y260= 140.55X+ 0.206 8 (R2=0.999 9)；Y275= 71.516X+ 0.210 3 (R2= 0.999 6)。

大豆苷元：Y240= 103.44X+ 0.223 3 (R2= 0.999 5)；Y249= 114.13X+ 0.221 9 (R2= 0.999 9)；Y254= 104.71X+0.224 9 (R2= 0.999 7)；Y260= 102.27X+ 0.222 3 (R2=0.999 9)；Y275= 65.761X+ 0.222 2 (R2= 0.999 7)。

芒柄花素：Y240= 103.1X+ 0.202 3 (R2= 0.999 7)；Y249= 112.42X+ 0.205 1 (R2= 0.999 7)；Y254= 105.95X+0.206 2 (R2= 0.999 7)；Y260= 100.15X+ 0.208 4 (R2=0.999 8)；Y275= 61.955X+ 0.209 9 (R2= 0.999 7)。

染料木素：Y240= 59.315X+ 0.213 8 (R2= 0.999 2)；Y249= 93.256X+ 0.212 6 (R2= 0.999 7)；Y254= 118.53X+0.212 3 (R2= 0.999 7)；Y260= 142.71X+ 0.212 5 (R2=0.999 9)；Y275= 71.06X+ 0.215 9 (R2= 0.999 7)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件分別對同一樣品不同標(biāo)準(zhǔn)品所測定的異黃酮含量進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較；利用Excel 2007制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉異黃酮的紫外分光光度法分析結(jié)果

即使是用同一種標(biāo)準(zhǔn)品，紅三葉提取物在240、249、254、260和275 nm測定的結(jié)果也相差非常大(表1)。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)(取代基數(shù)量和位置)和紫外吸收曲線，紅三葉的4種主要異黃酮成分可以分為兩組：FD組為芒柄花素和大豆苷元，BG組為鷹嘴豆素A和染料木素(圖1、圖2)。

在波長 ≤ 249 nm時，BG組測定的含量高于FD組(表1)。在240 nm處，標(biāo)準(zhǔn)品B和G的紫外吸收曲線處于波谷位置，特別是標(biāo)準(zhǔn)品B，吸收強(qiáng)度低，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高，也說明波長對測定結(jié)果的影響較大(表1)。在254 nm下，所測定的異黃酮含量濃度從大到小依次為 F ＞ D ＞ B ＞ G，這與 240和249 nm規(guī)律不一致，F(xiàn)和D之間、B和G之間差距較小，但兩組之間數(shù)值差距較大(表1)；260 nm的變化規(guī)律與254 nm基本一致，但FD組測定的含量高于254 nm，BG組含量低于254 nm，組間差距較254 nm增大(表1)；275 nm的變化規(guī)律與254、260 nm的相同，但是D、B和G這3種標(biāo)準(zhǔn)品測定的含量之間差值較小(表1)。這是由于同濃度的D、mg·g-1B和G的紫外吸收曲線在275 nm處有交叉，吸收強(qiáng)度接近，而F在此處吸收強(qiáng)度相對較弱，故測得的含量較高。在本研究選定的5個波長下，組內(nèi)B測定的含量大多高于G，F(xiàn)測定的含量大于D，但同組內(nèi)沒有顯著性差異。波長大于等于249 nm時，同一標(biāo)準(zhǔn)品所測得紅三葉異黃酮含量大多在275 nm處是最高值。

表1 不同標(biāo)準(zhǔn)品所標(biāo)定的紅三葉異黃酮含量Table 1 Isoflavone content in red clover extracts by using different standards

此外，同一個紅三葉樣品，不同波長或不同標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定的含量差異非常大。例如樣品Ⅱ的含量最低為10.23 mg·g-1(260 nm下，染料木素為標(biāo)準(zhǔn)品)，最高為17.07 mg·g-1(275 nm下，芒柄花素為標(biāo)準(zhǔn)品)。但是，如果只是比較含量的相對大小，則不同波長或不同標(biāo)準(zhǔn)品，對含量高低排序影響不大。5個樣品中異黃酮含量順序均為樣品Ⅴ ＞ 樣品Ⅱ ＞樣品Ⅰ ＞ 樣品Ⅲ ＞ 樣品Ⅳ。

3 討論

異黃酮是紅三葉植物主要的次生代謝物，具有重要生態(tài)功能與藥用價值。異黃酮含量的準(zhǔn)確測定對于該植物的研究和應(yīng)用都非常重要。生產(chǎn)實(shí)踐中，分光光度法是對該植物異黃酮總含量測定的主要方法之一，被廣泛采用。本研究表明，不同波長和標(biāo)準(zhǔn)品對異黃酮含量測定影響非常顯著，然而這在之前卻未見報道。

根據(jù)含量測定結(jié)果，作為含量檢測標(biāo)準(zhǔn)品的4種主要異黃酮化合物大體可分為兩組：FD組和BG組。組內(nèi)差異較小，組間差異較大(表1)。雖然4個化合物骨架均為黃酮結(jié)構(gòu)，但F和D為7位羥基和4'位氧取代的結(jié)構(gòu)，而B和G位為5、7位羥基和4'位氧取代的結(jié)構(gòu)(圖1)。這也解釋了組內(nèi)紫外吸收曲線相似度較高，測定含量較為接近的原因。

據(jù)文獻(xiàn)報道，很多波長均被應(yīng)用到紅三葉異黃酮的檢測中[15-16,18-29]，但未見對其所引起的誤差進(jìn)行比較研究和報道。通過觀察紫外吸收曲線，4個標(biāo)準(zhǔn)品化合物和紅三葉提取物在275 nm處有交叉，吸收強(qiáng)度差距小，而且曲線斜率也較為接近(圖2)。在275 nm處比較不同標(biāo)準(zhǔn)品的測定準(zhǔn)確度更為科學(xué)合理。在275 nm所處得到的結(jié)果中，標(biāo)準(zhǔn)品F測定含量較高。特別是樣品Ⅰ和Ⅴ，F(xiàn)所測定含量與其他標(biāo)準(zhǔn)品差異顯著(P＜ 0.05)?；诒狙芯拷Y(jié)果，建議利用B或G為標(biāo)準(zhǔn)品，在275 nm處測定紅三葉異黃酮含量更為準(zhǔn)確，兩個化合物測定結(jié)果數(shù)值接近，且無顯著差異(表1)。然而關(guān)于用B或G，還是混合使用的標(biāo)準(zhǔn)品使用方法，還需要進(jìn)一步的深入研究和探討，特別是需要大樣本的積累。本研究結(jié)果可以為測定異黃酮含量時提供一個較為理想的參考初始值，雖不能給出一個精確的測定方案，但將有助于提高總異黃酮含量測定的準(zhǔn)確度，而且希望通過本研究引起學(xué)界對標(biāo)準(zhǔn)品和波長選擇所帶來系統(tǒng)誤差的重視。

一般認(rèn)為，利用植物體內(nèi)含量較高的成分作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行表征，會提高紫外分光光度法的測定精度。紅三葉異黃酮含量會因生長環(huán)境、生理階段、采集部位甚至是樣品處理方式的不同引起其中成分與含量的變化[3,10,12-13,18]，同一種異黃酮成分在不同紅三葉樣品中的含量不同，同一個植物樣品中不同異黃酮成分含量也有差異，本研究結(jié)果中，利用不同化合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，均未改變樣品異黃酮含量的大小關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)品在植物的含量高低，與所測定結(jié)果關(guān)系并不密切。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同波長對半定量或定性比較異黃酮含量影響也較小。因此雖然不同文獻(xiàn)中不同測定方法得到的紅三葉異黃酮含量的絕對值，直接進(jìn)行比較可能存在一定誤差。但是本研究利用不同波長和標(biāo)準(zhǔn)品對紅三葉異黃酮含量的排序卻是可靠的，所得到的結(jié)論及優(yōu)化的提取純化工藝等是可行的[20,25,27]。