葛檣檣，王雪芬，宗 磊，卜勁松，盧德趙

(1.上虞人民醫(yī)院，浙江 上虞 312300；2.浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江 杭州 310053)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是引起心肌梗死、外周動脈疾病的主要原因。有研究表明，脂質(zhì)的代謝失衡在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1]。由過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、肝 X受體α(liver X receptor α，LXR-α)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)組成的通路是膽固醇逆轉(zhuǎn)運的重要通路[2]。絞股藍總皂苷(gypenosides，Gps)是絞股藍最主要的生物活性成分，具有降血脂、防治動脈粥樣硬的作用[3]。但其機制尚未明確。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的方法建立AS模型，研究絞股藍總皂苷對PPAR-γ/LXR-α/ABCA1信號通路的作用，以探討絞股藍總皂苷防治AS的分子機制。

1 材料

1.1 動物

20只ApoE-/-小鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2011-0003。實驗動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證：SYXK(浙)2013-0184。

1.2 主要試劑

絞股藍總皂苷購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(UV≥98%)，批號：J0423AS；PPARγ、LXR-α、ABCA1一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：22061-1-AP，14351-1-AP，25782-1-AP；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、羊抗鼠IgG 、羊抗兔IgG、RIPA裂解液、Trizon、eEcl化學發(fā)光顯影液、BCA試劑盒均購自北京康為世紀生物有限公司，批號分別為：30147、10146、10146、1915E、03877/0148、30223、50150。

2 方法

2.1 AS模型的建立及分組

20只ApoE-/-小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，即正常組、AS模型組、絞股藍總皂苷低劑量組、絞股藍總皂苷高劑量組，每組各5只。正常組：飼養(yǎng)時進食普通顆粒飼料；AS模型組：進食高脂飼料8周；絞股藍總皂苷低劑量組：在模型組的基礎(chǔ)上同時灌胃給藥，絞股藍總皂苷劑量為200 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥8周；絞股藍總皂苷高劑量組：在模型組的基礎(chǔ)上同時灌胃給藥，絞股藍總皂苷劑量為400 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥8周。

2.2 血脂檢測

眼球取血，全自動生化分析儀上檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)的含量。

2.3 病理形態(tài)學觀察

小鼠麻醉后，在冰上通過解剖獲取主動脈弓組織，10%福爾馬林溶液中固定。將主動脈弓(厚度約為4μm)的貼壁組織切片用蘇木精-伊紅(H&E)染色，檢測染色動脈粥樣硬化斑塊面積，并在尼康Ti-S 倒置顯微鏡的20×放大倍數(shù)下觀察異常結(jié)構(gòu)。通過IMAGEPRO PLUS軟件測定病變面積(μm2)。

2.4 熒光定量PCR檢測PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的表達

取主動脈組織，按Trizol 試劑盒說明書提取各組總RNA，并按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增。引物序列如表1所示。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進行數(shù)據(jù)分析。

2.5 免疫印跡法檢測PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白的表達

取各組主動脈血管，液氮研磨后加入 0.5 mL RIPA裂解液，而后置于冰上超聲破碎，4℃ 12000 rpm離心10 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗孵育2h，洗膜，化學顯影，分析各條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0 軟件進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 絞股藍總皂苷對血脂的影響

ApoE-/-小鼠高脂飼料飼養(yǎng)8周后，與正常組相比，模型組TC、TG、LDL-C、HDL-C顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，400 mg·kg-1絞股藍總皂苷處理后，TC、TG、LDL-C顯著下降(P<0.05)，并呈一定的劑量依賴性關(guān)系，而HDL-C無明顯的變化。見表1。

表1 AS小鼠血清中TC、FC、LDL-C、HDL-C的含量

注：LSD進行組間比較，其中：*與正常組比較，P<0.05；▲與模型組比較，P<0.05

3.2 絞股藍總皂苷對小鼠血管斑塊形成的影響

正常組小鼠的血管內(nèi)壁也有斑塊形成。而與正常組相比，模型組小鼠血管內(nèi)壁明顯增厚，可觀察到明顯的斑塊。用不同濃度的絞股藍總皂苷干預(yù)后，血管內(nèi)壁增厚的情況有所改善。說明絞股藍總皂苷能抑制血管的脂質(zhì)累積，從而抑制血管內(nèi)壁增生的形成，進而發(fā)揮抗AS的作用。

3.3 絞股藍總皂苷對小鼠主動脈PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的的影響

定量PCR法檢測了各組小鼠主動脈PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的表達情況，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的表達升高(P<0.05)，絞股藍總皂苷干預(yù)后，能顯著增加PPAR-γ、LXR-α、ABCA1的表達(P<0.05)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。見表2。

表2 絞股藍總皂苷對小鼠主動脈PPAR-γ、LXR-α、ABCA1mRNA的影響

注：LSD進行組間比較，其中：*與正常組比較，P<0.05；▲與模型組比較，P<0.05

3.4 絞股藍總皂苷對小鼠血管PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白表達的影響

應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測小鼠主動脈PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白表達的情況。結(jié)果表明，與模型組相比，400 mg·kg-1絞股藍總皂苷干預(yù)后，PPAR-γ、LXR-α、ABCA1表達量顯著增加(P<0.05)。見表3。以上結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果一致。說明絞股藍總皂苷可能通過激活PPAR-γ/LXR-α/ABCA1信號通路，促進膽固醇的外排，從而發(fā)揮抗AS的作用。

表3 絞股藍總皂苷對小鼠主動脈PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白表達的比較

注：LSD進行組間比較，其中：*與正常組比較，P<0.05；▲與模型組比較，P<0.05

4 討論

AS是心腦血管疾病的主要原因和病理基礎(chǔ)，而AS的發(fā)病機制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與脂質(zhì)累積、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖等緊密相關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組ApoE-/-小鼠經(jīng)8周高脂飼養(yǎng)后，血清中TC、TG和LDL-C的水平顯著升高，動脈粥樣硬化斑塊明顯增大。而用絞股藍總皂苷處理后，TC、TG和LDL-C水平明顯降低，主動脈中AS斑塊顯著變小，說明絞股藍總皂苷具有明顯的降血脂和抗AS的作用。

現(xiàn)有研究表明，上調(diào)ABCA1的表達，能顯著降低THP-1源性泡沫細胞脂質(zhì)的累積，減少泡沫細胞的形成[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠比較，AS模型小鼠中ABCA1表達也上調(diào)，主要原因為高脂狀態(tài)下，動物脂質(zhì)攝入過多，會應(yīng)激性地增加脂質(zhì)的代謝與外排。絞股藍總皂苷能夠在蛋白水平及基因水平上促進ABCA1的表達，促進膽固醇的流出，減少泡沫細胞的形成，抑制AS的進程。

ABCA1的表達受多種因素的調(diào)控，而PPAR-γ/LXR-α通路是調(diào)節(jié) ABCA1表達的核心機制。肝臟X受體作為核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控ABCA1及ABCG1的轉(zhuǎn)錄,進而調(diào)節(jié)膽固醇的轉(zhuǎn)運[7]。我們也在研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，200mg·kg-1和400mg·kg-1絞股藍總皂苷灌胃處理AS小鼠后，能夠促進PPAR-γ、LXR-α的表達。

綜上所述，絞股藍總皂苷能降低ApoE-/-AS模型小鼠血清中TC、FC、LDL-C的含量；激活PPAR-γ/LXR-α/ABCA1信號通路，促進膽固醇外流，減少泡沫細胞的形成，進而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。