劉倩倩，王春玥，宋晨曦，李一平，伏蕊，朱成剛，竇克非

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦亲畛Ｒ姷男难芗膊?，但其確切的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確[1-3]。在過去十年里，關(guān)于動(dòng)物及人類代謝組學(xué)方面的研究均取得巨大進(jìn)步，通過聯(lián)合使用靶向及非靶向的方法，代謝組學(xué)已經(jīng)識(shí)別出多種不同心血管疾病相關(guān)的代謝物指標(biāo)[4-6]。目前針對(duì)冠心病的靶向代謝組學(xué)研究開展較多，但能夠反映冠心病患者整體內(nèi)環(huán)境的代謝標(biāo)志物及發(fā)病機(jī)制為導(dǎo)向的非靶向代謝組學(xué)研究卻開展得十分有限。因此，本研究借助超高效液相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography coupled to quadruple time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF/MS）的非靶向代謝組學(xué)方法分析了嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈狹窄的冠心病患者和冠狀動(dòng)脈造影正常者之間的血漿代謝物差異。

1 資料與方法

研究對(duì)象：本研究入選了2011年6月至2015年3月于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院接受擇期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療或冠狀動(dòng)脈造影的住院患者300例，并分為兩組，即冠心病組（n=150），患者冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄（狹窄≥80%）；和年齡與性別 1：1 匹配的冠狀動(dòng)脈造影正常（狹窄≤20%）的對(duì)照組（n=150）。并利用UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學(xué)方法，分析兩組患者血漿代謝圖譜并挖掘兩組間差異性最顯著的代謝物（圖1）。本研究經(jīng)阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者及其家屬均簽署了知情同意書。

樣本采集和處理：造影前采集空腹靜脈血置于肝素抗凝管中，4℃ 2 300 rpm離心10 min后取上清，12 000 rpm離心15 min后取400 μl分裝至凍存管，-80℃條件下保存直至上機(jī)檢測(cè)。

UHPLC-QTOF/MS檢測(cè)：運(yùn)用UHPLC-QTOF/MS的代謝組學(xué)檢測(cè)方法，并利用陽(yáng)離子相和陰離子相兩種電離模式聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)血清進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)離子檢測(cè)。色譜條件：序列中每隔8個(gè)檢測(cè)樣本插入一個(gè)空白樣本（75%乙腈溶液）和一個(gè)質(zhì)量控制（QC）樣本，進(jìn)樣量為4 μl。色譜柱為Waters ACQUITY UHPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為0.1% 甲酸溶解于水（陽(yáng)離子相）或0.5 mM氟化銨陰離子相）溶解于水；流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶解于乙腈溶液（陽(yáng)離子相）或乙腈溶液（陰離子相）。質(zhì)譜條件：質(zhì)量掃描范圍：50～1 200 mz；掃描速率：4質(zhì)譜/s。鞘氣溫度：400℃；干燥氣溫度：250℃；鞘氣流速：12 L/min；干燥氣流速：16 L/min；噴霧電壓：20 psi （陽(yáng)離子模式）或40 psi（陰離子模式）；噴嘴電壓：0 V。

數(shù)據(jù)預(yù)處理與分析：首先使用ProteoWizard將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式，然后使用 XCMS（xcms4dda、xcms4 lipid）程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行處理，并檢索自建庫(kù)并獲得矩陣數(shù)據(jù)表，矩陣數(shù)據(jù)表中包括質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間（RT）、峰面積。使用CAMERA軟件對(duì)XCMS處理過的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰篩選，其后利用LOESS回歸模型對(duì)QC樣本進(jìn)行歸一化處理，與 QC匹配度低于80%的數(shù)據(jù)被棄去。

圖1 臨床研究技術(shù)路線

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：所有數(shù)據(jù)應(yīng)用 SAS 9.4 軟件進(jìn)行分析。連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。分類變量用頻數(shù)及百分比表示并以卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。利用多元線性回歸模型，分析校正傳統(tǒng)冠心病危險(xiǎn)因素和檢測(cè)批次等因素后冠心病組與對(duì)照組之間血漿顯著性差異代謝物小分子。利用Bonferroni校正，將顯著性差異的閾值設(shè)置為P＜8.2×10-5（0.05/611）以減少假陽(yáng)性錯(cuò)誤概率。利用Logistic 回歸模型分析代謝物與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者臨床基線資料的比較（表1）：冠心病組和對(duì)照組患者的體重指數(shù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相較對(duì)照組，冠心病組患者高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙及冠心病家族史比例均明顯更高（P均＜0.05）。

冠心病患者血漿代謝組學(xué)變化（圖2）：本研究對(duì)冠心病組和對(duì)照組之間的差異代謝物進(jìn)行了多元線性回歸分析。

圖2 105個(gè)冠心病人群血漿差異小分子代謝物成分分類圖

在校正傳統(tǒng)冠心病危險(xiǎn)因素（年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙）和檢測(cè)批次后，共篩選出105個(gè)兩組間差異顯著的代謝物，其中包含84種已知代謝物和21種未知代謝物。組間顯著性差異代謝物主要包含51 種甘油磷脂類、10 種肉毒堿、8 種游離脂肪酸、5 種膽汁酸代謝產(chǎn)物、3 種氨基酸類以及7 種未統(tǒng)一分類代謝物，其中脂質(zhì)代謝異常（甘油磷脂類、肉毒堿、游離脂肪酸）占總代謝狀態(tài)改變的65.74%，是總代謝狀態(tài)改變的主要原因，這驗(yàn)證了既往研究所報(bào)道的脂質(zhì)代謝異常在冠心病發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

最具預(yù)測(cè)性的冠心病相關(guān)的血漿代謝物（表2）：經(jīng)過多元線性回歸分析及Bonferroni校正后，從上述105種差異代謝物中篩選出5種差異最為顯著的血漿代謝物（P均＜0.05），即棕櫚酸、亞油酸、脂酰肉毒堿（14：1）、石膽酸、磷脂酰甘油（20：3/2：0）。校正危險(xiǎn)因素后，Logistic 回歸模型分析結(jié)果顯示，這5種代謝物與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)（OR=2.791～7.237）。

表2 5種組間差異性最顯著的代謝物及其與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)

3 討論

本研究借助UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學(xué)方法分析了冠心病患者和冠狀動(dòng)脈造影正常者之間血漿代謝物水平的差異。研究一共篩選出105個(gè)差異性代謝物，其中脂質(zhì)代謝（磷脂、肉毒堿、游離脂肪酸）占總代謝狀態(tài)改變的65.74%，并從中篩選出5種差異最為顯著的血漿代謝物，其在冠心病組均顯著高于對(duì)照組，且與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)，OR值范圍從石膽酸的 2.791到棕櫚酸的7.237。

冠心病組患者血漿棕櫚酸水平顯著高于對(duì)照組，是冠心病相關(guān)性最高的代謝物之一，同時(shí)也是冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)能力最高的代謝物（OR=7.237，95% CI：2.390～21.912，P=0.0001），這與既往多項(xiàng)研究結(jié)果一致[7-8]。近期一項(xiàng)臨床試驗(yàn)Meta分析結(jié)果顯示，棕櫚酸（16：0）可以顯著增加總膽固醇及低密度脂蛋白（LDL）水平[9]。另外一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了棕櫚酸可以通過觸發(fā)炎癥相關(guān)信號(hào)通路而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，從而具有誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化形成的潛力[10]。

本研究中，亞油酸血漿水平每升高1個(gè)單位，冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)就增加6.133倍（95% CI：2.367～15.893，P=0.0005)。最近研究發(fā)現(xiàn)，作為日常生活中最常見的ω-6多不飽和脂肪酸的亞油酸攝入增加后會(huì)提高5年內(nèi)全因死亡風(fēng)險(xiǎn)、心血管疾病包括冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[11]，這與本研究結(jié)果也是一致的。至于亞油酸水平增加引起心血管發(fā)病的機(jī)制，有研究證實(shí)與氧化型油酸代謝物（oxidized linoleic acid metabolites，OXLAMs）的升高有關(guān)，而OXLAMs具有誘使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的作用導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成[12-15]。

本研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了磷脂酰甘油（20：3/2：0）與冠心病的強(qiáng)相關(guān)性。目前較少研究關(guān)注過磷脂酰甘油這一亞類的甘油磷脂，本研究首先報(bào)道了人血漿中磷脂酰甘油（20：3/2：0）水平與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)正相關(guān)的結(jié)果（OR=3.938，95% CI：1.891～8.204，P=0.0001）。早前有研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型的血漿中磷脂酰甘油類水平顯著升高[16]，這也間接驗(yàn)證了本文的研究結(jié)果。

幾乎所有有關(guān)冠心病的代謝組學(xué)研究都報(bào)道過肉毒堿類代謝物在冠心病人群與對(duì)照人群中的差異，本研究中也發(fā)現(xiàn)了一種中鏈的脂酰肉毒堿（14：1）與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)（OR=3.379，95%CI：1.913～5.967，P＜0.0001）。有研究發(fā)現(xiàn)血漿中肉毒堿水平的升高與巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程中β氧化功能不全有關(guān)，而巨噬細(xì)胞脂質(zhì)超載向巨噬泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起到至關(guān)重要的作用[17]。

目前關(guān)于石膽酸與血管病變的研究并不多，本研究首先發(fā)現(xiàn)血漿石膽酸水平的升高與冠心病患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)（OR=2.791，95% CI：1.74～4.477，P=0.0003）。Charach等[18]通過糞便代謝組學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)冠心病患者排泄膽汁酸的能力下降，因此不能擺脫體內(nèi)過高的脂質(zhì)負(fù)荷，這也可以解釋本研究結(jié)果中冠心病患者血漿中石膽酸的堆積。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)瘀膽癥的患者體內(nèi)石膽酸的堆積能夠引起肝組織炎癥反應(yīng)，相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)顯示石膽酸能夠通過激活核因子-κB（NF-KB）和P38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）相關(guān)炎癥通路而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[19]，間接提示石膽酸可能具有致動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

本研究局限性：本研究為單中心病例對(duì)照研究，雖然借助先進(jìn)的代謝組學(xué)手段挖掘出許多代謝標(biāo)志物與冠心病患病之間的關(guān)聯(lián)，但尚不能為其因果性提供依據(jù)，因此還需要在前瞻性隊(duì)列研究以及細(xì)胞及動(dòng)物的相關(guān)干預(yù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究借助UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學(xué)方法分析了嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈狹窄冠心病患者和冠狀動(dòng)脈造影正常者之間血漿代謝物水平的差異。本研究不僅提供了更全面的冠心病血漿代謝圖譜改變，還首次挖掘出了石膽酸和磷脂酰甘油（20：3/2：0）這兩種與冠心病病理生理過程有強(qiáng)關(guān)聯(lián)的潛在生物標(biāo)志物，為從整體水平探索冠心病動(dòng)脈粥樣硬化病理生理機(jī)制及尋求新的治療途徑供了依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突