劉倩倩，王春玥，宋晨曦，李一平，伏蕊，朱成剛，竇克非

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦亲畛Ｒ姷男难芗膊。浯_切的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確[1-3]。在過去十年里，關(guān)于動物及人類代謝組學(xué)方面的研究均取得巨大進(jìn)步，通過聯(lián)合使用靶向及非靶向的方法，代謝組學(xué)已經(jīng)識別出多種不同心血管疾病相關(guān)的代謝物指標(biāo)[4-6]。目前針對冠心病的靶向代謝組學(xué)研究開展較多，但能夠反映冠心病患者整體內(nèi)環(huán)境的代謝標(biāo)志物及發(fā)病機(jī)制為導(dǎo)向的非靶向代謝組學(xué)研究卻開展得十分有限。因此，本研究借助超高效液相色譜—飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography coupled to quadruple time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF/MS）的非靶向代謝組學(xué)方法分析了嚴(yán)重冠狀動脈狹窄的冠心病患者和冠狀動脈造影正常者之間的血漿代謝物差異。

1 資料與方法

研究對象：本研究入選了2011年6月至2015年3月于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院接受擇期經(jīng)皮冠狀動脈介入治療或冠狀動脈造影的住院患者300例，并分為兩組，即冠心病組（n=150），患者冠狀動脈嚴(yán)重狹窄（狹窄≥80%）；和年齡與性別 1：1 匹配的冠狀動脈造影正常（狹窄≤20%）的對照組（n=150）。并利用UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學(xué)方法，分析兩組患者血漿代謝圖譜并挖掘兩組間差異性最顯著的代謝物（圖1）。本研究經(jīng)阜外醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，入組患者及其家屬均簽署了知情同意書。

樣本采集和處理：造影前采集空腹靜脈血置于肝素抗凝管中，4℃ 2 300 rpm離心10 min后取上清，12 000 rpm離心15 min后取400 μl分裝至凍存管，-80℃條件下保存直至上機(jī)檢測。

UHPLC-QTOF/MS檢測：運用UHPLC-QTOF/MS的代謝組學(xué)檢測方法，并利用陽離子相和陰離子相兩種電離模式聯(lián)合檢測，對血清進(jìn)行一級、二級離子檢測。色譜條件：序列中每隔8個檢測樣本插入一個空白樣本（75%乙腈溶液）和一個質(zhì)量控制（QC）樣本，進(jìn)樣量為4 μl。色譜柱為Waters ACQUITY UHPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1% 甲酸溶解于水（陽離子相）或0.5 mM氟化銨陰離子相）溶解于水；流動相B為0.1%甲酸溶解于乙腈溶液（陽離子相）或乙腈溶液（陰離子相）。質(zhì)譜條件：質(zhì)量掃描范圍：50～1 200 mz；掃描速率：4質(zhì)譜/s。鞘氣溫度：400℃；干燥氣溫度：250℃；鞘氣流速：12 L/min；干燥氣流速：16 L/min；噴霧電壓：20 psi （陽離子模式）或40 psi（陰離子模式）；噴嘴電壓：0 V。

數(shù)據(jù)預(yù)處理與分析：首先使用ProteoWizard將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為mzXML格式，然后使用 XCMS（xcms4dda、xcms4 lipid）程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行處理，并檢索自建庫并獲得矩陣數(shù)據(jù)表，矩陣數(shù)據(jù)表中包括質(zhì)荷比（m/z）、保留時間（RT）、峰面積。使用CAMERA軟件對XCMS處理過的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰篩選，其后利用LOESS回歸模型對QC樣本進(jìn)行歸一化處理，與 QC匹配度低于80%的數(shù)據(jù)被棄去。

圖1 臨床研究技術(shù)路線

統(tǒng)計學(xué)分析方法：所有數(shù)據(jù)應(yīng)用 SAS 9.4 軟件進(jìn)行分析。連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用t檢驗進(jìn)行比較。分類變量用頻數(shù)及百分比表示并以卡方檢驗進(jìn)行比較。利用多元線性回歸模型，分析校正傳統(tǒng)冠心病危險因素和檢測批次等因素后冠心病組與對照組之間血漿顯著性差異代謝物小分子。利用Bonferroni校正，將顯著性差異的閾值設(shè)置為P＜8.2×10-5（0.05/611）以減少假陽性錯誤概率。利用Logistic 回歸模型分析代謝物與疾病發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者臨床基線資料的比較（表1）：冠心病組和對照組患者的體重指數(shù)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；相較對照組，冠心病組患者高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙及冠心病家族史比例均明顯更高（P均＜0.05）。

冠心病患者血漿代謝組學(xué)變化（圖2）：本研究對冠心病組和對照組之間的差異代謝物進(jìn)行了多元線性回歸分析。

圖2 105個冠心病人群血漿差異小分子代謝物成分分類圖

在校正傳統(tǒng)冠心病危險因素（年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙）和檢測批次后，共篩選出105個兩組間差異顯著的代謝物，其中包含84種已知代謝物和21種未知代謝物。組間顯著性差異代謝物主要包含51 種甘油磷脂類、10 種肉毒堿、8 種游離脂肪酸、5 種膽汁酸代謝產(chǎn)物、3 種氨基酸類以及7 種未統(tǒng)一分類代謝物，其中脂質(zhì)代謝異常（甘油磷脂類、肉毒堿、游離脂肪酸）占總代謝狀態(tài)改變的65.74%，是總代謝狀態(tài)改變的主要原因，這驗證了既往研究所報道的脂質(zhì)代謝異常在冠心病發(fā)病機(jī)制中的重要作用。

最具預(yù)測性的冠心病相關(guān)的血漿代謝物（表2）：經(jīng)過多元線性回歸分析及Bonferroni校正后，從上述105種差異代謝物中篩選出5種差異最為顯著的血漿代謝物（P均＜0.05），即棕櫚酸、亞油酸、脂酰肉毒堿（14：1）、石膽酸、磷脂酰甘油（20：3/2：0）。校正危險因素后，Logistic 回歸模型分析結(jié)果顯示，這5種代謝物與冠心病發(fā)病風(fēng)險顯著正相關(guān)（OR=2.791～7.237）。

表2 5種組間差異性最顯著的代謝物及其與冠心病患病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)

3 討論

本研究借助UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學(xué)方法分析了冠心病患者和冠狀動脈造影正常者之間血漿代謝物水平的差異。研究一共篩選出105個差異性代謝物，其中脂質(zhì)代謝（磷脂、肉毒堿、游離脂肪酸）占總代謝狀態(tài)改變的65.74%，并從中篩選出5種差異最為顯著的血漿代謝物，其在冠心病組均顯著高于對照組，且與冠心病發(fā)病風(fēng)險顯著正相關(guān)，OR值范圍從石膽酸的 2.791到棕櫚酸的7.237。

冠心病組患者血漿棕櫚酸水平顯著高于對照組，是冠心病相關(guān)性最高的代謝物之一，同時也是冠心病發(fā)病風(fēng)險預(yù)測能力最高的代謝物（OR=7.237，95% CI：2.390～21.912，P=0.0001），這與既往多項研究結(jié)果一致[7-8]。近期一項臨床試驗Meta分析結(jié)果顯示，棕櫚酸（16：0）可以顯著增加總膽固醇及低密度脂蛋白（LDL）水平[9]。另外一項體外實驗也驗證了棕櫚酸可以通過觸發(fā)炎癥相關(guān)信號通路而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，從而具有誘發(fā)動脈粥樣硬化形成的潛力[10]。

本研究中，亞油酸血漿水平每升高1個單位，冠心病的患病風(fēng)險就增加6.133倍（95% CI：2.367～15.893，P=0.0005)。最近研究發(fā)現(xiàn)，作為日常生活中最常見的ω-6多不飽和脂肪酸的亞油酸攝入增加后會提高5年內(nèi)全因死亡風(fēng)險、心血管疾病包括冠心病的發(fā)病風(fēng)險[11]，這與本研究結(jié)果也是一致的。至于亞油酸水平增加引起心血管發(fā)病的機(jī)制，有研究證實與氧化型油酸代謝物（oxidized linoleic acid metabolites，OXLAMs）的升高有關(guān)，而OXLAMs具有誘使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的作用導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成[12-15]。

本研究也進(jìn)一步驗證了磷脂酰甘油（20：3/2：0）與冠心病的強(qiáng)相關(guān)性。目前較少研究關(guān)注過磷脂酰甘油這一亞類的甘油磷脂，本研究首先報道了人血漿中磷脂酰甘油（20：3/2：0）水平與冠心病患病風(fēng)險正相關(guān)的結(jié)果（OR=3.938，95% CI：1.891～8.204，P=0.0001）。早前有研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化大鼠模型的血漿中磷脂酰甘油類水平顯著升高[16]，這也間接驗證了本文的研究結(jié)果。

幾乎所有有關(guān)冠心病的代謝組學(xué)研究都報道過肉毒堿類代謝物在冠心病人群與對照人群中的差異，本研究中也發(fā)現(xiàn)了一種中鏈的脂酰肉毒堿（14：1）與冠心病患病風(fēng)險顯著相關(guān)（OR=3.379，95%CI：1.913～5.967，P＜0.0001）。有研究發(fā)現(xiàn)血漿中肉毒堿水平的升高與巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝過程中β氧化功能不全有關(guān)，而巨噬細(xì)胞脂質(zhì)超載向巨噬泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化在動脈粥樣硬化的形成中起到至關(guān)重要的作用[17]。

目前關(guān)于石膽酸與血管病變的研究并不多，本研究首先發(fā)現(xiàn)血漿石膽酸水平的升高與冠心病患病風(fēng)險呈正相關(guān)（OR=2.791，95% CI：1.74～4.477，P=0.0003）。Charach等[18]通過糞便代謝組學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)冠心病患者排泄膽汁酸的能力下降，因此不能擺脫體內(nèi)過高的脂質(zhì)負(fù)荷，這也可以解釋本研究結(jié)果中冠心病患者血漿中石膽酸的堆積。多項研究發(fā)現(xiàn)瘀膽癥的患者體內(nèi)石膽酸的堆積能夠引起肝組織炎癥反應(yīng)，相關(guān)體外實驗顯示石膽酸能夠通過激活核因子-κB（NF-KB）和P38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）相關(guān)炎癥通路而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[19]，間接提示石膽酸可能具有致動脈粥樣硬化的作用。

本研究局限性：本研究為單中心病例對照研究，雖然借助先進(jìn)的代謝組學(xué)手段挖掘出許多代謝標(biāo)志物與冠心病患病之間的關(guān)聯(lián)，但尚不能為其因果性提供依據(jù)，因此還需要在前瞻性隊列研究以及細(xì)胞及動物的相關(guān)干預(yù)實驗中進(jìn)行驗證。

綜上所述，本研究借助UHPLC-QTOF/MS的非靶向代謝組學(xué)方法分析了嚴(yán)重冠狀動脈狹窄冠心病患者和冠狀動脈造影正常者之間血漿代謝物水平的差異。本研究不僅提供了更全面的冠心病血漿代謝圖譜改變，還首次挖掘出了石膽酸和磷脂酰甘油（20：3/2：0）這兩種與冠心病病理生理過程有強(qiáng)關(guān)聯(lián)的潛在生物標(biāo)志物，為從整體水平探索冠心病動脈粥樣硬化病理生理機(jī)制及尋求新的治療途徑供了依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突