張曼莉，張曼娜，陳慧，趙昆，劉芳，劉志寬，佟飛

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）時，在炎癥、氧化應(yīng)激等因素作用下，引起內(nèi)皮損傷、單核細胞黏附、脂質(zhì)顆粒聚集、泡沫細胞形成和血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖、遷移，最終導致血管內(nèi)膜增生和粥樣斑塊的形成[1]。血管內(nèi)膜增生、炎癥與AS、支架術(shù)后再狹窄等血管重構(gòu)性疾病密切相關(guān)。有研究報道，Krüppel樣因子5（Krüppel-like factors 5，KLF5）在血管重構(gòu)性疾病尤其AS中與細胞增殖和炎癥密切相關(guān)[2-3]。脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是人體血液循環(huán)中最豐富的一種類固醇激素。有研究顯示，DHEA可抑制VSMC增殖，在AS過程中發(fā)揮保護作用[4]。那么，在小鼠內(nèi)皮層完整的血管損傷模型中（如頸動脈結(jié)扎或不完全結(jié)扎），DHEA是否具有抑制內(nèi)膜增生和炎癥的作用目前鮮有報道。本文應(yīng)用小鼠頸動脈結(jié)扎法誘導內(nèi)膜增生模型，觀察DHEA在結(jié)扎誘導的內(nèi)膜增生和局部炎癥應(yīng)答中的抑制作用。

1 材料與方法

材料及儀器：DHEA（Abcam公司，英國）；鼠抗增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體（Abcam公司，英國）；鼠抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）單克隆抗體（Abcam公司，英國）；鼠抗白細胞介素（IL）-6單克隆抗體（Abcam公司，英國）；兔抗KLF5多克隆抗體（GeneTex公司，美國）；鼠抗β肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；總RNA提取試劑盒（OMEGA公司，美國）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司，美國）；SYBR Green定量PCR（qPCR）kit（Invitrogen公司，美國）；核酸定量儀（Eppendorf公司，德國）；PCR擴增儀（Eppendorf公司，德國）；ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR（qRT-PCR）擴增儀（ABI公司，美國）；電泳儀（Bio-rad公司，美國）；ECL化學發(fā)光儀（Vilber Lourmat 公司，法國）。

動物分組：30只健康雄性18～20周齡C57BL/6小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（合格證編號11400700128532）。所有實驗動物均受到人道對待，實驗方案獲得實驗動物倫理委員會批準。30只小鼠隨機分為對照組、結(jié)扎組和DHEA治療組，每組10只。

動物模型的建立：按照Kumar等[5]報道的方法建立小鼠頸動脈結(jié)扎模型： C57BL/6小鼠用2 %異氟烷進行吸入性麻醉；固定小鼠于無菌手術(shù)臺上，頸部伸直呈仰臥位，手術(shù)部位皮膚去毛，碘伏局部消毒；用無菌剪沿頸正中線剪開皮膚約0.5 cm，顯微彎鑷鈍性分離甲狀腺和肌肉，從近心端向遠心端鈍性分離并暴露左側(cè)頸總動脈；結(jié)扎組和DHEA治療組在頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉點用無菌手術(shù)線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈；對照組僅把無菌手術(shù)線置于左側(cè)頸總動脈分叉點下而不結(jié)扎。手術(shù)傷口用青霉素處理后縫合；術(shù)后將小鼠單籠喂養(yǎng)。對照組和結(jié)扎組于手術(shù)后給予普通飼料。DHEA治療組于手術(shù)后第3天開始每天給予含有DHEA的飼料[0.4% W/W，相當于100 mg/（kg·d）]。術(shù)后第21天處死小鼠，快速分離小鼠結(jié)扎處頸動脈，冷PBS洗凈血液，去除血管外結(jié)締組織。用于蘇木素-伊紅染色的組織，用4%多聚甲醛固定。用于qRT-PCR、蛋白免疫印跡實驗的組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蘇木素-伊紅（HE）染色步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；蘇木素染色；1%鹽酸酒精分化；伊紅染色；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；鏡下觀察、照相，Image-Pro Plus Analyzer version 5.1軟件（美國）測量并計算頸動脈內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜面積（I/M）比值。

RNA提取和qRT-PCR：取出凍存的血管組織，用Trizol法提取總RNA，核酸定量儀檢測RNA的純度和濃度。按照美國Invitrogen公司“用于qRT-PCR的M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)”操作說明，取1～3 μg總RNA建立20 μg逆轉(zhuǎn)錄體系合成互補DNA（cDNA）。然后用美國Invitrogen公司的“Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG with ROX”試劑盒和ABI 7500 Fast qRT-PCR擴增儀進行熒光擴增。相對定量的方法采用比較Ct法，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用△Ct（Ct目的-Ct內(nèi)參）法進行相對定量分析，以2-△Ct作為目的RNA的相對表達量。引物序列見表1。

蛋白免疫印跡實驗分析：提取各組小鼠組織總蛋白，用改良的Lowry法進行蛋白定量。取等量蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后進行半干轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢，取出聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，放置在含5 %脫脂奶粉的Tween 20/TBS（TBST）封閉液中，于室溫封閉2 h后，將封閉后的PVDF膜用TBST適當漂洗，然后放入用一抗稀釋液稀釋的一抗中，4℃放置過夜。次日，取出PVDF膜用TBST適當漂洗，將PVDF膜置入用適當TBST稀釋的化學發(fā)光二抗中，室溫反應(yīng)2 h，取出PVDF膜用TBST適當漂洗。最后用化學發(fā)光儀檢測抗體特異結(jié)合條帶。信號強度用Image J軟件進行相對定量分析。用Graph Pad Prism 5軟件作圖。

統(tǒng)計學方法：采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理分析，計量資料均經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組之間均數(shù)的統(tǒng)計學差異采用Student's t檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

三組小鼠頸動脈的形態(tài)學分析結(jié)果（圖1、表2）：結(jié)扎組與對照組相比，頸動脈內(nèi)膜面積[（4.05±0.26）×104μm2vs （0.47±0.05）×104μm2]顯 著 增 大，I/M比 值（2.85±0.19 vs 0.14±0.02）顯著升高；DHEA治療組與結(jié)扎組相 比，內(nèi) 膜 面 積[（1.16±0.17）×104μm2vs（4.05±0.26）×104μm2]減小，I/M比值（0.78±0.15 vs 2.85±0.19）明顯降低；上述組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

三組小鼠頸動脈組織中PCNA的mRNA和蛋白表達情況（表3、圖2）：結(jié)扎組與對照組相比，頸動脈組織中PCNA的mRNA（2.96±0.07 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.21±0.22 vs 1.00±0.01）表達水平明顯升高；DHEA治療組與結(jié)扎組相比，頸動脈組織中PCNA的mRNA（1.42±0.09 vs 2.96±0.07）和蛋白（1.39±0.19 vs 3.21±0.22）表達水平顯著降低；上述組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

圖1 三組小鼠頸動脈的蘇木素-伊紅染色結(jié)果（×10）

表2 三組小鼠頸動脈內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比值(n=10,

表2 三組小鼠頸動脈內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜面積比值(n=10,

注：與對照組比較*P＜0.05；與結(jié)扎組比較△P＜0.05

項目 對照組 結(jié)扎組 DHEA治療組內(nèi)膜面積(×104 μm2) 0.47±0.05 4.05±0.26* 1.16±0.17△內(nèi)膜/中膜面積比值 0.14±0.02 2.85±0.19* 0.78±0.15△

表3 三組小鼠頸動脈組織中PCNA的mRNA表達水平(n=10,

表3 三組小鼠頸動脈組織中PCNA的mRNA表達水平(n=10,

注：PCNA：增殖細胞核抗原；mRNA：信使RNA；DHEA：脫氫表雄酮。與對照組比較*P＜0.05；與結(jié)扎組比較△P＜0.05

PCNA mRNA表達水平 1.00±0.01 2.96±0.07* 1.42±0.09△

圖2 三組小鼠頸動脈組織中PCNA蛋白電泳結(jié)果（2A） 和表達水平（2B）

三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達情況（表4、圖3）：結(jié)扎組與對照組相比，頸動脈組織中TNF-α的mRNA（3.05±0.09 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.75±0.30 vs 1.00±0.01）表達水平顯著升高，IL-6的mRNA（2.79±0.07 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.01±0.28 vs 1.00±0.01）表達水平也顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。DHEA治療組與結(jié)扎組相比，頸動脈組織中TNF-α的mRNA（1.28±0.08 vs 3.05±0.09）和蛋白（1.49±0.26 vs 3.75±0.30）表達水平明顯降低，IL-6的mRNA（1.31±0.09 vs 2.79±0.07）和蛋白（1.24±0.19 vs 3.01±0.28）表達水平也明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

表4 三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6的mRNA表達水平(n=10，

表4 三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6的mRNA表達水平(n=10，

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6；mRNA：信使RNA；DHEA：脫氫表雄酮。與對照組比較*P＜0.05；與結(jié)扎組比較△P＜0.05

TNF-α mRNA表達水平 1.00±0.01 3.05±0.09* 1.28±0.08△IL-6 mRNA表達水平 1.00±0.01 2.79±0.07* 1.31±0.09△

圖3 三組小鼠頸動脈組織中TNF-α和IL-6蛋白電泳結(jié)果（3A） 和表達水平（3B）

三組小鼠頸動脈組織中KLF5的mRNA和蛋白表達情況（表5、圖4）：結(jié)扎組與對照組相比，頸動脈組織中KLF5的mRNA（2.64±0.07 vs 1.00±0.01）和蛋白（3.89±0.34 vs 1.00±0.01）表達水平顯著升高，分別升高約2.6倍和3.9倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；DHEA治療組與結(jié)扎組相比，頸動脈組織中KLF5的mRNA（1.38±0.06 vs 2.64±0.07）和蛋白（1.67±0.21 vs 3.89±0.34）表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

表5 三組小鼠頸動脈組織中KLF5的mRNA表達水平（n=10

表5 三組小鼠頸動脈組織中KLF5的mRNA表達水平（n=10

注：KLF5：Krüppel樣因子5；mRNA：信使RNA；DHEA：脫氫表雄酮。與對照組比較*P＜0.05；與結(jié)扎組比較△P＜0.05

KLF5 mRNA表達水平 1.00±0.01 2.64±0.07* 1.38±0.06△

注：DHEA：脫氫表雄酮；KLF5：Krüppel樣因子5；β-actin：β肌動蛋白。與對照組比較*P＜0.05；與結(jié)扎組比較△P＜0.05

3 討論

心腦血管疾病是當今社會威脅人類健康的主要疾病之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢[6]。病理性血管重構(gòu)可導致多種血管疾?。òˋS、高血壓、動脈瘤等）發(fā)生、發(fā)展，其中AS是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。在AS的發(fā)生、發(fā)展和并發(fā)癥發(fā)生中，局部和全身的炎癥以及細胞增殖起著重要作用。AS形成的最早期表現(xiàn)為脂質(zhì)條紋形成：內(nèi)皮細胞導致的特異性黏附分子表達引起白細胞趨化，趨化的單核細胞或巨噬細胞觸發(fā)產(chǎn)生IL-1、TNF-α和IL-6等炎癥因子。炎癥細胞遷移到內(nèi)皮下引起上述細胞因子釋放，刺激VSMC增殖，引起斑塊進展，導致管腔狹窄、斑塊破裂、血栓形成[7-8]。研究表明，抑制反映細胞增殖狀態(tài)的增殖相關(guān)基因（PCNA）和炎癥相關(guān)基因（IL-1β、IL-6）的表達可阻止AS的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。盡管有諸多關(guān)于AS的研究，但迄今為止，AS的發(fā)病機制仍不完全清楚。由于內(nèi)膜增生和炎癥在AS發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，因此研究具有抑制血管內(nèi)膜增生和炎癥雙重作用的藥物就更加讓人期待。

KLF家族中的KLF5在不同組織中廣泛表達，是一種促細胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子，在血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤發(fā)育和AS形成過程中，KLF5可以促進細胞增殖[10-11]。此外，KLF5與炎癥也密不可分。前期體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，在血管重構(gòu)過程中，高糖通過上調(diào)KLF5的表達，進而促進TNF-α等炎癥基因表達[12]。Chen等[13]的研究也證明了KLF5可促進炎癥因子的表達。由此可見，無論在腫瘤還是AS的發(fā)生、發(fā)展過程中，KLF5與細胞增殖和炎癥都密切相關(guān)。因此，研發(fā)一種可以抑制KLF5表達、同時抑制細胞增殖和炎癥的藥物，將為AS的預防和治療提供新的思路。

DHEA是成年人體內(nèi)循環(huán)中最豐富的甾體激素，主要以脫氫表雄酮硫酸酯（DHEA-S）的形式進入血液循環(huán)中，在外周組織中轉(zhuǎn)化為雄激素或雌激素發(fā)揮間接生物學效應(yīng)。流行病學研究表明，血漿DHEA-S水平與AS發(fā)病率、心血管疾病全因死亡風險以及致死性、非致死性心血管事件的發(fā)生率呈負相關(guān)，在男性中尤為突出[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，DHEA通過抗細胞增殖來治療肺動脈高壓[16]。那么，DHEA在AS形成過程中能否抑制血管重構(gòu)以及如何發(fā)揮抑制作用？DHEA是否具有抑制增殖相關(guān)基因（PCNA）和炎癥相關(guān)基因（TNF-α和IL-6）的表達而發(fā)揮抑制血管內(nèi)膜增生和炎癥雙重作用？結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，DHEA能否影響有促細胞增殖、促炎作用的KLF5的表達？為了研究這些問題，本研究采用了雄性小鼠頸動脈結(jié)扎的血管內(nèi)膜增生模型，觀察DHEA對增殖相關(guān)基因（PCNA）、炎癥相關(guān)基因（TNF-α和IL-6）和KLF5表達的影響，探討DHEA對血管內(nèi)膜增生、血管炎癥和KLF5的作用。結(jié)果顯示，形態(tài)學觀察到DHEA可明顯抑制血管內(nèi)膜增生，在mRNA和蛋白質(zhì)水平，DHEA顯著抑制增殖相關(guān)基因（PCNA）、炎癥相關(guān)基因（TNF-α和IL-6）和KLF5的表達，證明了DHEA具有抑制血管增生和炎癥的雙重作用。由此推測，DHEA發(fā)揮抑制血管內(nèi)膜增生和炎癥因子的表達可能一定程度上是通過抑制KLF5的表達來實現(xiàn)的，但DHEA是直接還是間接發(fā)揮此作用，以及其中具體的分子機制，尚需進一步的研究來證實。

綜上所述，我們通過小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，DHEA能夠抑制血管內(nèi)膜增生和炎癥因子的表達，DHEA還可以抑制轉(zhuǎn)錄因子KLF5的表達。因此推測，DHEA發(fā)揮抑制AS的作用一定程度上是通過抑制有促細胞增殖和促炎作用的KLF5來實現(xiàn)的。本研究為揭示DHEA抑制AS的發(fā)生機制，為防治AS提供了新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突