梁劍光 祝金山 趙明霞 栗波 王立梅

(1 常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院，常州 213164；2 常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，常熟 215500；3 浙江錢江生物化學(xué)股份有限公司，海寧 314400；4 蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州 215123)

春雷霉素，又稱春日霉素，商品名稱為加收米，是由肌醇和二基已糖組成的雙糖類物質(zhì)，其化學(xué)分子式為C14H25N3O9(圖1)，呈弱堿性[1]。春雷霉素由小金色鏈霉菌(Streptomyces microaureus)在發(fā)酵過程中分泌產(chǎn)生，在農(nóng)用和醫(yī)療上都具有重要作用，可用于防治革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的感染，醫(yī)療上對銅綠假單胞菌的感染治療上有極好的效果[2]；春雷霉素農(nóng)業(yè)上作農(nóng)用殺菌劑，對稻瘟病具有突出的防效和治療作用，并對人畜毒性較低，對環(huán)境亦無污染作用[3]。目前國內(nèi)生產(chǎn)廠家較少[4]，其原料主要由延邊春雷生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，因此，提高春雷霉素菌株的高產(chǎn)特性具有重要現(xiàn)實意義。

圖1 春雷霉素分子結(jié)構(gòu)[1]Fig.1 Structures of kasugamycin

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試驗菌株

CIT-04菌株由常熟理工學(xué)院梁劍光老師實驗室提供。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基(%)：黃豆餅粉1.5，食用豆油1，KH2PO40.08，NaCl 0.3，蠶蛹粉0.1，玉米漿0.1，酵母膏0.3，甘油0.6，pH6.7～6.8。(2)初始發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：黃豆餅粉 3，食用豆油2，KH2PO40.05，NaCl 0.3，蛋白胨0.3，麥芽糖2，pH6.6～6.7。

1.1.3 主要儀器設(shè)備與試劑

恒溫培養(yǎng)搖床購于上海世平實驗設(shè)備有限公司；細菌培養(yǎng)箱購于上海申賢恒溫設(shè)備廠；低溫離心機(H-2050R)購于長沙湘儀離心機儀器有限公司制造；麥芽糖、葡萄糖、碳酸鈣、酵母粉、春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品等試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

標(biāo)準(zhǔn)品春雷霉素2.0%的水劑為2mg/kg，即相當(dāng)于2萬單位，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同的濃度，采用管碟法測定春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品效價，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2 高產(chǎn)菌株的種子制備

用250mL錐形瓶，裝液量30mL，滅菌后在超凈臺上挑取大小約為0.5cm×0.5cm菌塊，接入種子培養(yǎng)基中，于28℃旋轉(zhuǎn)式搖床(240r/min)培養(yǎng)30～36h，菌濃(pacted mycelium volume,PMV)達到15%～20%再接入發(fā)酵瓶中。

1.2.3 菌濃(PMV)的測定

取10mL菌液注入10mL有蓋離心管內(nèi)，于冷凍離心機中離心10min(離心轉(zhuǎn)速10000r/min)，再計算壓縮體積與總液體體積比。

1.2.4 春雷霉素菌株搖瓶發(fā)酵

取250mL錐形瓶，每瓶裝液量為30mL，滅菌后在超凈臺上從種子液中取4.0mL接入發(fā)酵瓶中，于28℃旋轉(zhuǎn)式搖床(240～260r/min，濕度45%～49%)培養(yǎng)168～192h，檢測發(fā)酵過程中的春雷霉素效價。

1.2.5 春雷霉素效價測定(管碟法)

春雷霉素發(fā)酵后經(jīng)過離心，取上清液，將牛津杯至于含枯草芽孢指示菌的雙層固體平板上，牛津杯放置應(yīng)盡量保持間距相等，每個牛津杯加入200μL發(fā)酵處理后的上清液(發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù))，將平板放于4℃冰箱1h左右，便于抗菌素擴散。隨后，再移入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30h，取出測量抑菌圈大小，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品曲線與效價關(guān)系

本實驗設(shè)計7個濃度梯度，分別是500、750、1000、1250、1500、1750和2000U/mL。采用雙層平板(牛津杯法)測定標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈。主要結(jié)果見圖2，通過線性擬合，得出春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈直徑與效價關(guān)系方程：y=0.74x+1.77(R=0.9996)，見圖3，數(shù)據(jù)擬合良好。

2.2 高產(chǎn)菌株CIT-04菌體形態(tài)特征與菌體濃度關(guān)系

實驗設(shè)計12組春雷霉素菌株CIT-04種子液，每組3瓶，每隔3h測1次菌濃，結(jié)果見表1。從表1可以看出，菌濃PMV在12h之前僅增加1.0%，比較緩慢，但從12h之后，菌濃開始快速增加，而在33h后，菌濃達到25%，36h稍有下降趨勢。這說明，種子搖瓶搖床培養(yǎng)較為適合的時間點在第33小時左右，這時根據(jù)菌形和菌濃初步判斷為該菌種的最佳接種時間。

從種子鏡檢圖4中可以看出，培養(yǎng)24h種子液的菌體含量較少，菌體形態(tài)與細菌類非常相似，正處于分裂之中，有的呈彎曲或弧形狀。培養(yǎng)30和33h種子液的菌體在鏡檢視野中數(shù)量明顯增多，且短桿菌狀增多，這與一般放線菌的形態(tài)有較大差別。

圖2 春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品抑菌圈效果Fig.2 The inhibitory zone of kasugamycin standard substance

圖3 春雷霉素效價的標(biāo)準(zhǔn)品曲線Fig.3 Standard titer curve of kasugamycin

表1 種子培養(yǎng)基中菌株CIT-04菌體濃度(PMV)變化情況Tab.1 PMV of strain CIT-04 cultured at seed stage

圖4 春雷霉素菌株CIT-04在種子培養(yǎng)中培養(yǎng)時間與菌形變化Fig.4 Pellets morphology of strain CIT-04 grown at seed stage

2.3 春雷霉素菌株CIT-04發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素實驗

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中復(fù)合碳源對發(fā)酵的影響

首先根據(jù)文獻查閱資料，分別采用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇進行糖類發(fā)酵實驗，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中其他成分不變。第7天測定春雷霉素菌株的發(fā)酵效價，結(jié)果如表2所示：以麥芽糖作為糖類發(fā)酵結(jié)果效價最高，其次是蔗糖，葡萄糖最低。因此，麥芽糖是比較適合作為春雷霉素發(fā)酵的碳源，與文獻報道基本一致。

在此實驗基礎(chǔ)上，以麥芽糖為基礎(chǔ)碳源，再選擇食用豆油、玉米油和菜油與麥芽糖組合作為春雷霉素發(fā)酵培養(yǎng)基中的復(fù)合碳源，在第7天對菌株發(fā)酵效價進行測定，結(jié)果如表3所示。食用豆油作為與麥芽糖搭配為復(fù)合碳源，菌株具有較高的發(fā)酵效價，其次是玉米油，綜合考慮成本等因素，食用豆油是作為較好的一種碳源。

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中幾種有機氮源對發(fā)酵效價的影響

選用黃豆餅粉、花生餅粉和豆粕粉作為氮源，分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵效價測定，結(jié)果如表4。

表2 不同碳源(糖類)對應(yīng)春雷霉素效價影響Tab.2 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on different carbon sources

表3 不同油類碳源所對應(yīng)的春雷霉素效價Tab.3 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on different oil sources

因此，黃豆餅粉效果最好，花生餅粉也有明顯效果，而豆粕粉的效果較差。因而，有機氮源選擇黃豆餅粉較為合適。

2.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Mg2+對效價的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基配方添加Ca2+(以CaCl2計)、Mg2+(以MgSO4計)比較發(fā)酵效果，其中有一組不添加任何離子作為對照組。實驗結(jié)果如表5。

由表5結(jié)果可知，Mg2+的促進作用是很明顯的，Ca2+的添加沒有明顯影響，從而，可以選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇添加Mg2+從而獲得更高的發(fā)酵效價。

2.3.4 正交設(shè)計實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

上述篩選出的幾種因素：麥芽糖、黃豆餅粉、食用豆油、Mg2+進行正交試驗設(shè)計L9(34)。正交實驗分析如表6所示。

從表7可以看出，極差由大到小排列為：黃豆餅粉＞食用豆油＞麥芽糖＞Mg2+，這說明黃豆餅粉的影響最大，其次分別是食用豆油、麥芽糖、Mg2+。因此，本實驗篩選出的最佳發(fā)酵配方為：黃豆餅粉4%、食用豆油2.5%、KH2PO40.05%、玉米漿0.1%、NaCl 0.5%、魚粉蛋白胨0.5%、麥芽糖3.0%、蠶蛹粉1.0%、MgSO40.03%。通過搖瓶實驗驗證后，菌株CIT-04發(fā)酵效價達到18780U/mL。

表4 不同有機氮源對應(yīng)春雷霉素效價Tab.4 Titers of kasugamycin produced by CIT-04 grown on different nitrogen sources

表5 添加金屬離子對春雷霉素的效價影響Tab.5 Effect of metal ions on kasugamycin titer

表6 L9(34)正交試驗表頭設(shè)計Tab.6 The orthogonal experimental design [L9(34)]

3 結(jié)論與展望

本文主要對高產(chǎn)菌株CIT-04產(chǎn)春雷霉素種子菌體形態(tài)和發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化研究，通過本實驗最終得出如下結(jié)論：種子培養(yǎng)33h菌濃(PMV)達25%接種時機最佳；通過對其發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素篩選和正交優(yōu)化試驗，確定培養(yǎng)基配方為：黃豆餅粉4%、食用豆油2.5%、KH2PO40.05%、玉米漿0.1%、NaCl 0.5%、蛋白胨0.5%、麥芽糖3%、蠶蛹粉1%、MgSO40.03%，最終高產(chǎn)菌株春雷霉素發(fā)酵效價可達到18780U/mL。

表7 正交設(shè)計實驗結(jié)果Tab.7 The result of orthogonal experimental [L9(34)]

春雷霉素作為農(nóng)用殺菌劑以其高效、低毒、低污染而得到廣大用戶的喜愛[5-6]。然而，春雷霉素目前國內(nèi)生產(chǎn)廠家較少，其菌株和工藝有待進一步提升[7]。展望未來，春雷霉素生物合成和基因功能研究已逐漸清晰[8-9]，但產(chǎn)業(yè)化和應(yīng)用推廣上還有待擴展，比如春雷霉素對銅綠假單胞菌的感染治療效果突出，希望能進一步開發(fā)成為一種新藥投入市場，使患者受益。目前春雷霉素醫(yī)藥價值還未開發(fā)，春雷霉素也能有望在醫(yī)藥學(xué)上大放光彩?？傊?，今后對春雷霉素生產(chǎn)工藝而言，進一步選育高產(chǎn)的菌株依然是今后提高產(chǎn)量的關(guān)鍵手段，其次是拓展其應(yīng)用范圍，開發(fā)更有價值的春雷霉素衍生物。