王璐瑤 于佳樂 劉帥瑩 董彩鳳 白春英 張俊毅

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）在中國是一種常見的上消化道惡性腫瘤。根據(jù)GLOBOCAN 2018 估計［1］，食管癌的發(fā)病率在全球癌癥排名中位居第七位，而中國的食管癌發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的一半。在中國［2］，男性中癌癥發(fā)病率第三位的是食管癌。因此，中國食管癌的防控形勢非常嚴重。

支架蛋白（scaffolding protein）Erbin 定位在細胞連接半橋粒處，屬于LAP（the leucine-rich repeat and PDZ domain protein）家族成員之一。Erbin 最初被認為對神經(jīng)軸突髓鞘的形成至關重要［3］。后來發(fā)現(xiàn)Erbin通過與δ-catenin［4］等多個黏附連接蛋白結(jié)合而對上皮細胞極性的維持［5］、信號轉(zhuǎn)導和細胞黏附發(fā)揮重要作用［6］。然而，Erbin 在惡性腫瘤中扮演何種角色尚有爭論。有研究報道，Erbin 蛋白在肝細胞肝癌［7］、乳腺癌［8］中表達增加，并且與腫瘤的組織學分化程度呈正相關。相反地，Erbin 也具有抑癌作用。Erbin通過抑制細胞周期進程而顯著降低宮頸癌細胞的增殖［9］。

本研究利用組織芯片檢測299例ESCC蠟塊標本中Erbin 的表達情況，結(jié)果顯示Erbin 的表達在ESCC組織中顯著增高，并且與ESCC患者的不良預后密切相關，報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本與患者資料

299例食管癌患者的標本、40例非典型增生的食管上皮組織（18例低級別和22例高級別）、47例癌旁正常食管上皮組織（距原發(fā)腫瘤邊界5 cm以上）標本均收集自赤峰學院附屬醫(yī)院病理科和汕頭市中心醫(yī)院病理科2007年～2011年存檔蠟塊。所有病例術前均未接受放療和化療。男性233例，女性66例，中位年齡58 歲。按照美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）于2017年修訂的腫瘤TNM 分期標準［10］：Ⅰ期28 例，Ⅱ期137例，Ⅲ期134 例，Ⅳ期0 例；高分化45 例，中分化229例，低分化25例。另外，位于食管上段的腫瘤19例，中段134 例，下段146 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例148例，沒有轉(zhuǎn)移的151例。所有病例均有詳實的術后隨訪資料，其生存時間的計算是從手術日期到由于復發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期或到末次隨訪日期為止，且所有死亡患者的死因均與食管癌有關。患者最長隨訪時間為60 個月，平均隨訪時間為26.74 個月。此外，為了驗證免疫組織化學的檢測結(jié)果，本研究另收集了25例冷凍的食管癌及配對的癌旁正常食管組織用于提取RNA和蛋白。所有標本的使用均征得了倫理委員會同意且患者本人或家屬知情。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制備 組織芯片的制作參考本課題組已發(fā)表的文獻［11］。

1.2.2 免疫組織化學染色 組織芯片被制成4μm連續(xù)切片；二甲苯脫蠟和梯度酒精水化后，切片再經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波抗原修復；3%H2O2和非免疫血清分別滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性與非特異性結(jié)合位點，之后切片再與一抗Erbin或δ-catenin在4℃條件下孵育過夜。Erbin抗體（英國Abcam公司，山羊抗人多抗，且針對人源性Erbin的C端氨基酸設計該抗體的免疫原性）的使用滴度為1:100。δ-catenin抗體（英國Abcam公司，兔抗人多抗，且針對人源性δ-catenin的第1 150位氨基酸殘基到C端設計該抗體的免疫原性）的使用滴度為1:100。第二天，切片經(jīng)PBS沖洗后，滴加生物素標記的二抗（UltraSensitiveTMSP免疫組織化學試劑盒，福州邁新生物公司），DAB顯色，蘇木素復染。PBS代替一抗做陰性對照，以排除二抗的非特異性結(jié)合。

1.2.3 免疫組織化學結(jié)果的判讀 細胞胞漿中出現(xiàn)棕色顆粒被認為是陽性信號。染色強度分為4級：0：陰性；1：弱染色；2：中度染色；3：強染色。陽性細胞百分數(shù)分為5級：0：absent；1：1%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：≥76%。對于陽性染色區(qū)域一致的標本，每個標本的總分數(shù)是由腫瘤細胞染色強度和腫瘤細胞陽性百分數(shù)兩部分的乘積得出，范圍是0～12。當切片上的陽性染色區(qū)域不一致時，每一區(qū)域單獨評分并最后相加得出該標本的最終分數(shù)。例如，標本中75%的腫瘤細胞為中度染色（3×2=6），其余25%的腫瘤細胞為弱染色（1×1=1），那么該標本的最終分數(shù)為6+1=7。為了方便統(tǒng)計，本研究把所有病例分為2組：Erbin：0～1分為陰性表達組，2～12分為陽性表達組。δ-catenin的評分標準參照文獻［11］。

1.2.4 PCR 檢測 利用TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）提取食管癌組織中的總RNA，然后借助逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒（大連TaKaRa生物公司）得到互補DNA。Erbin 引物的設定來自參考文獻［12］：5′-C ATCTCACCAAACGACCGAC-3′，5′-GAGCCCGCCTT GTAGAGCC-3′。β-actin 引物序列：5′-AGAGCTAC GAGCTGCCTGAC-3′和5′-AGTACTTGCGCTCAGG AGGA-3′。Erbin/β-actin的灰度比值作為Erbin基因的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5 蛋白印跡檢測 組織裂解物用來提取總蛋白。取等量總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜（美國Millipore公司）。隨后PVDF膜與Erbin抗體（1:200；Abcam）在4℃條件下孵育過夜，再與HRP 標記的二抗（1:5 000；Santa Cruz）在室溫下孵育2個小時，利用ECL化學發(fā)光并觀察蛋白條帶。利用FluorChem 8900圖像分析系統(tǒng)（美國Alpha公司）進行圖像采集和定量分析。目的蛋白與相應β-actin蛋白（1:1 000，美國Sigma公司）的比值作為該目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。Erbin 表達與患者臨床病理因素的關系采用Pearson′s Chi-Square 檢驗?；颊呱娣治霾捎肒aplan-Meier 法，Log-Rank 檢驗患者生存率的差別。2 個蛋白表達的相關性采用Pearson 相關檢驗。Cox 多因素風險比例模型用作評估影響患者預后的獨立危險因子。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Erbin蛋白和mRNA在ESCC組織中的表達

47例癌旁正常食管上皮的免疫組織化學染色顯示（圖1），Erbin的陽性信號主要位于鱗狀上皮的基底細胞，且定位在基底細胞的胞漿。在299 例ESCC 組織中（圖1），Erbin 的表達也定位在腫瘤細胞的胞漿，但陽性細胞數(shù)和染色強度顯著增加，其陽性表達率為55.2%（165/299），明顯高于癌旁正常食管上皮的表達（0/47，P＜0.001）。此外，也檢測了40例非典型增生的食管上皮中Erbin的表達情況。低級別非典型增生病例的Erbin陽性表達率是0（0/18），而高級別非典型增生病例的Erbin 陽性表達率是31.8%（7/22）。高級別非典型增生病例的Erbin陽性表達率高于低級別增生（P＜0.001），但低于ESCC組織的表達率（P＜0.001）。

借助蛋白印跡和PCR 方法，在25 例配對的食管癌和癌旁正常食管組織中檢測了Erbin蛋白和基因的表達情況（圖1～3）。與正常食道上皮組織相比，ESCC 組織中Erbin 的蛋白和基因表達明顯增高（P＜0.05，圖4）。

選取60例ESCC組織并借助免疫組織化學方法檢測δ-catenin蛋白的表達情況（圖5）。δ-catenin在ESCC組織中的陽性表達率為61.67%（37/60），且陽性信號位于腫瘤細胞的胞漿，顯著高于正常食管上皮的表達（0/47，P＜0.001）。Pearson相關分析顯示δ-catenin和Erbin的表達具有顯著正相關（r=0.626，P＜0.001，表1）。

圖1 Erbin在正常食管上皮和食管癌組織中的表達

?圖2 Erbin在正常食管上皮（N）和食管癌組織（T）中的基因（A）和蛋白（B）表達

?圖3 Erbin 在25 對正常食管上皮（N）和食管癌組織（T）中的蛋白表達

?圖4 Erbin 在25 對正常食管上皮（N）和食管癌組織（T）中的基因表達

圖5 δ-catenin在正常食管上皮和食管癌組織中的表達

表1 Erbin與δ-catenin在ESCC中表達的相關性

2.2 Erbin在ESCC組織中的高表達與患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的關系

免疫組織化學結(jié)果顯示Erbin 在ESCC 組織中的表達顯著增高，其表達與患者臨床病理因素的關系見表2。Erbin 在Ⅲ～Ⅳ期中的陽性表達率為64.9%（87/134），高 于Ⅰ～Ⅱ期 的47.3%（78/165，P=0.002）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中Erbin的陽性表達率為65.5%（97/148），高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的45.0%（68/151，P＜0.001）。然而，Erbin的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分化程度或腫瘤浸潤深度均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 Erbin在ESCC組織中的陽性表達與患者的不良預后的關系

Kaplan-Meier 生存分析表明（圖4），134 例Erbin陰性表達患者的平均生存時間為（39.486±1.960）個月（95%CI=35.644～43.328），而165 例Erbin 陽性表達患者的平均生存時間為（33.544±1.793）個月（95%CI=30.030～37.058），Erbin陽性表達患者的生存時間顯著短于陰性表達的患者（Log-Rank 檢驗χ2=4.633，P=0.031）。

Cox多因素風險模型顯示（表3），Erbin的陽性表達不是ESCC患者預后的獨立危險因素（Risk=1.215，95%CI=0.867～1.705，P=0.258）。然而，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（Risk=2.032，95%CI=1.461～2.826，P＜0.001）、TNM 分 期（Risk=2.050，95% CI=1.481～2.836，P＜0.001）和腫瘤組織的分化程度（Risk=0.532，95%CI=0.322～0.878，P=0.014）均是判斷ESCC 患者預后的獨立危險因素，而腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤浸潤深度和性別均不是獨立的危險因素（P=0.530，0.446，0.605，0.236）。值得注意的是，年齡也具有獨立的預測ESCC 患者預后的能力（Risk=1.422，95%CI=1.030～1.962，P=0.032）。

表2 ESCC中Erbin的表達與各臨床病理參數(shù)之間的關系

圖4 299例ESCC患者根據(jù)Erbin表達狀態(tài)分類的Kaplan-Meier生存分析

表3 多變量Cox 回歸對299 例ESCC 患者的臨床病理參數(shù)的危險度預測分析

3 討論

有文獻報道Erbin在皮膚表皮的基底細胞層為胞漿彌漫染色，在表皮上部的細胞為胞膜染色，而在皮膚鱗癌組織中Erbin 的表達顯著增加，且既有胞漿表達，也有胞膜表達［13］。與皮膚中的表達模式不同，本研究顯示Erbin蛋白在正常食管鱗狀上皮細胞中呈微弱的胞漿表達，且陽性表達率為0（0/47），而在ESCC組織中表達顯著增加，其陽性表達率為55.2%（165/299）。本研究也發(fā)現(xiàn)食管鱗狀上皮高級別異型增生病例的Erbin陽性表達率高于低級別異型增生和正常鱗狀上皮的表達（P＜0.001），但低于鱗狀細胞癌的表達（P＜0.001），說明Erbin的表達促進了腫瘤的侵襲進展。此外，Erbin 的表達與食管癌pTNM 分期（P=0.002）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)（P＜0.001）呈正相關，說明Erbin 不但促進食管癌患者的臨床進展，而且也參與了腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另外，與癌旁正常食管組織相比，本研究顯示Erbin蛋白和基因表達水平在ESCC組織中均明顯增高，這與免疫組織化學中的結(jié)果相一致，證明Erbin 蛋白表達增多主要是由于其基因轉(zhuǎn)錄增加所導致的，與在肝細胞肝癌［7］、乳腺癌［8］、結(jié)直腸癌組織［14］中的研究結(jié)果一致，而且其表達與腫瘤TNM 分期呈正相關，這與本研究在食管癌中得到的結(jié)果是一致的。上述研究結(jié)果均說明Erbin在惡性腫瘤的演進中可能扮演重要的促癌角色。然而，是在結(jié)直腸癌組織中進行研究，另一篇報道顯示Erbin 的mRNA 和蛋白表達均明顯減少［15］，并且Erbin 通過抑制ERK 和Akt 信號通路的活性而發(fā)揮抑癌作用。在同樣的腫瘤中Erbin的表達模式完全相反的情況需要進一步驗證。此外，本研究顯示Erbin 陽性表達的ESCC患者的生存時間明顯短于陰性表達的患者（P=0.031），提示Erbin 在食管癌的進展中扮演了促癌角色。然而，多因素風險模型顯示Erbin 的表達并不是判斷食管癌患者預后的一個獨立危險因素（P=0.258），而腫瘤的分化程度、pTNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是ESCC患者獨立的預后因素。值得注意的是，年齡也是食管癌患者預后的一個獨立因素（P=0.032），推測可能隨著年齡的增加食管鱗狀上皮發(fā)生非典型增生的幾率增高，進而發(fā)展到鱗狀細胞癌的發(fā)生概率也明顯高于年齡較低的人群。

同樣是在乳腺癌組織中進行的研究，有報道稱Erbin的mRNA和蛋白表達均顯著減少［12］，并且Erbin通過抑制Akt信號通路的活性而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，該結(jié)果顯示Erbin 具有抑癌蛋白的作用，這與上文在乳腺癌中的研究結(jié)果正好相反［8］。推測Erbin在相同的腫瘤中出現(xiàn)相反的表達可能與實驗標本數(shù)量有關。前者用做免疫組織化學實驗的乳腺癌組織標本僅為20 例，而后者用作免疫組織化學實驗的乳腺癌標本多達171 例，因此需要進一步擴大樣本量去驗證Erbin在乳腺癌組織中的確切表達情況。本研究選取了較大樣本的ESCC 組織進行檢測，得出Erbin 在腫瘤組織中表達增加的結(jié)論進一步明確了其作為促癌蛋白在參與食管癌侵襲進展過程中扮演的重要角色。當然，Erbin 可能在不同的腫瘤甚至相同的腫瘤中扮演截然相反的角色，但這不排除可能與腫瘤細胞的類型以及Erbin 在腫瘤細胞中的定位有關，特別是Erbin在細胞膜或細胞質(zhì)的定位與其在腫瘤演進中扮演的“雙重身份”可能密切相關，需要深入研究。

Erbin 與δ-catenin 同屬黏附連接蛋白，且兩者可以直接結(jié)合而參與上皮細胞的連接和上皮極性的維持。既往研究已經(jīng)闡釋了δ-catenin的mRNA和蛋白表達水平在食管癌［11］、肺癌［16］組織中顯著增加，而且δ-catenin 的陽性表達與患者的不良預后密切相關。因此在本研究中，Erbin 與δ-catenin 在腫瘤演進過程中所扮演的促癌角色是一致的，且兩者在ESCC組織中的表達顯著正相關（r=0.626，P＜0.001），說明兩個蛋白具備功能上的結(jié)合效應。眾所周知，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以通過降解細胞外基質(zhì)而在腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，在食管癌中Erbin是否通過增強MMPs的活性而促進腫瘤細胞的侵襲，需要借助食管癌細胞系開展深入研究。

綜上所述，本研究揭示了Erbin的表達在ESCC組織中明顯增加，且Erbin的陽性表達與食管癌患者的不良預后密切相關，這對將來開發(fā)針對Erbin的腫瘤靶向藥物奠定了實驗基礎，而明確Erbin促進食管癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制是本課題組下一步的研究方向。