賴銳 宋英 劉惟優(yōu) 袁小亮

(1.贛南醫(yī)學(xué)院，贛州341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科，贛州 341000)

既往研究采用乙醇和十六烷基三甲基溴化銨 (Cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) 特異性沉淀法從新生隱球菌H99培養(yǎng)上清中分離和純化莢膜多糖獲得葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan，GXM)[1-2]。但按照此方法提取GXM存在一些不足，提取GXM所得到的混合莢膜多糖溶液(GXM和GalXM)不可避免混雜有少量隱球菌菌體，干擾后續(xù)純化過程，且純化GXM后期需要透析1周時(shí)間，使得GXM純化過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而透析后GXM溶液有可能不純，含有少量CTAB可對小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。為克服以上幾點(diǎn)不足，本研究對乙醇和CTAB特異性沉淀法進(jìn)行了針對性改良，具體步驟詳述如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新生隱球菌和格特隱球菌分別采用H99及R265標(biāo)準(zhǔn)株，由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存提供。真菌培養(yǎng)采用酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(YNB) 。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 、酵母氮基礎(chǔ)(YNB) 購自Sigma 公司。硫酸、無水乙醇、NaCl、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純試劑。C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀(美國BD Bioscience公司)。2.4G2小鼠封閉抗體、APC anti-mouse CD3 antibody 、7-AAD(7-amino-actinomycin D)購自美國Biolegend公司。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院倫理學(xué)委員批準(zhǔn)。

1.2 真菌培養(yǎng)

從沙氏平板上挑取H99和R265單個(gè)菌落，分別接種至250 mL 酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)液(Yeast nitrogen base，YNB)中，置于搖床30℃以100 r/min搖菌培養(yǎng)4～5 d。增菌培養(yǎng)液121℃高壓滅菌15 min，5000 r/min離心20 min，棄沉淀，收集上清液。

1.3 莢膜多糖的分離

于上清液中緩慢加入3倍體積(750 mL)的無水乙醇，溶液出現(xiàn)牛奶樣白色沉淀，搖勻后置4℃過夜。次日于5000 r/min離心10 min收集沉淀，棄上清，風(fēng)干沉淀。加20 mL滅菌用水溶解沉淀后形成黏稠溶液，即為GXM及GalXM多糖混合物?；旌隙嗵侨芤阂?0 mL注射器吸取先后通過0.8 μm及0.2 μm無菌針頭式過濾器(Millipore，默克公司)，進(jìn)一步去除隱球菌菌體，混合多糖液墨汁染色顯微鏡下觀察確定隱球菌菌體完全清除。

1.4 混合多糖濃度的測定

GXM及GalXM多糖濃度采用苯酚硫酸法[1]檢測：首先配制濃度為10 mg/mL的葡萄糖溶液，為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線: 取6個(gè)玻璃管，每管加蒸餾水1 mL和60%苯酚50 μL，按順序每管分別相應(yīng)加入濃度為10 mg/mL的葡萄糖0、5、10、20、40、80 μL，混勻。再加入2.5 mL濃硫酸(濃硫酸應(yīng)直接滴入玻璃管中，不能沿管壁加入)后混勻。20 min內(nèi)于450 nm測量光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)取待測樣品20、40、80 μL按相同方法測量光密度值，取平均值計(jì)算混合多糖含量。

1.5 CTAB沉淀GXM

常溫下20 mL的多糖溶液中加入濃度為2 mol /L的NaCl 2.23 mL，使NaCl終濃度調(diào)整為0.2 mol/L，然后緩慢加入濃度為0.3%CTAB，邊加邊攪拌，CTAB加入量至少為多糖含量的3倍，如50 mg多糖溶液至少應(yīng)加入0.3%的CTAB 50 mL (150 mg CTAB) 。然后，緩慢加入2倍體積的0.05%CTAB，邊加邊攪拌，隨著NaCl濃度降低，白色絮狀沉淀(GXM-CTAB復(fù)合物，見圖1)逐漸形成。常溫過夜，GXM-CTAB復(fù)合物逐漸沉淀下來。第2天再緩慢滴入0.05%CTAB直至上清無新沉淀產(chǎn)生保持澄清為止，確保GXM被完全沉淀出來。5000 r/min離心10 min收集沉淀，沉淀以10%乙醇洗1遍，風(fēng)干，此為CTAB-GXM復(fù)合物。然后加20 mL濃度為1 mol/L的NaCl溶解沉淀，溶解需要過夜，此時(shí)形成似甘油樣黏稠溶液CTAB-GXM-NaCl。

圖1 混合莢膜多糖溶液印度墨汁染色

1.6 CIA 純化GXM

首先配制25 mL比例為24∶1氯仿：異戊醇混合液(Chlorofom: isoamyl alcohol, 24∶1 v/v；CIA)。以4 mL CIA液加入20 mL CTAB-GXM-NACL中，混勻后以5000 r/min離心6 min，混合液分為3層，澄清水相層位于上端，渾濁有機(jī)層位于下端，兩層相交的界面包含少量不能溶解物質(zhì)。將每10 mL水相層液體轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中(避免吸取交界面不能溶解物質(zhì))，先后加入滅菌用水10 mL和異丙醇30 mL，-30℃過夜使GXM完全沉淀。4℃ 5000 r/min離心10 min，棄上清收集沉淀，24 h風(fēng)干后以5 mL無菌1×PBS 4℃過夜溶解沉淀。以前述的苯酚硫酸法測定GXM濃度后存于-30℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 流式細(xì)胞儀檢測

為了解純化的GXM對細(xì)胞的毒性作用，以GXM溶液與小鼠脾細(xì)胞共孵育后檢測CD3陽性的T淋巴細(xì)胞。取C57BL/6小鼠脾臟，去除紅細(xì)胞制備成脾細(xì)胞懸液。以終濃度為100 μg/mL的GXM與小鼠脾細(xì)胞(終濃度為2×105/mL)37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱共孵育20 h。收集孵育后的細(xì)胞，首先以2.4 G2封閉抗體在4℃孵育15 min，然后以APC anti-mouse CD3于4℃避光染色30 min。在檢測前10 min加入7-AAD 1 μL，以BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀檢測CD3+的T淋巴細(xì)胞活性比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 傳統(tǒng)法GXM的提取

在CTAB特異性沉淀法提取GXM過程中所得到的混合莢膜多糖溶液(GXM和GalXM)不可避免混雜有少量隱球菌菌體(見圖2)，干擾后續(xù)純化過程。甚至所純化的H99GXM(刺激終濃度100 μg/mL)與小鼠脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)20 h，可引起小鼠CD3+T淋巴細(xì)胞死亡(見圖3，P3=0%)。究其原因，在提取GXM過程中由于GXM-CTAB復(fù)合物不易溶解于水(見圖1)。

2.2 改良法GXM的提取

①多糖含量的測定：首先用苯酚硫酸法測量了不同含量的葡萄糖在450nm的光密度值(OD)，縱坐標(biāo)為糖含量，橫坐標(biāo)為OD值，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4)，得到了多糖含量的計(jì)算方程: Y= 4.4071X2+7.0747X-0.3399，Y代表多糖濃度(mg/mL)，X代表OD450值。H99待測樣品3管，分別測其OD450值為0.082、0.111、0.168，換算濃度分別為1.08、1.00、0.97 mg /mL，取平均值為1.02 mg/mL。R265待測樣品3管，分別測其OD450值為0.112、0.170、0.285，換算濃度分別為2.03、 1.98、2.03 mg/mL，取平均值為2.01 mg/mL?；旌隙嗵侨芤后w積為20 mL，結(jié)果提示從H99和R265隱球菌250 mL培養(yǎng)上清中分別獲得GXM及GalXM多糖混合物約20 mg和40 mg。②GXM含量的測定：H99和R265混合多糖經(jīng)CTAB特異性沉淀GXM，再使用異丙醇沉淀CTAB-GXM溶液中的GXM，最終獲得GXM溶液5 mL，同樣取3管(20 μL、40 μL、80 μL樣品)使用苯酚硫酸法測量它們的濃度。H99GXM的濃度分別為1.43、1.61、1.65 mg/mL，取平均值為1.56 mg/mL，獲得了約7.8 mg的H99GXM。R265GXM的濃度分別為3.78、3.61、3.52 mg/mL，取平均值為3.63 mg/mL，獲得了約18 mg的R265GXM。H99GXM和R265GXM獲得率(GXM/GXM和GalXM混合多糖)分別為39% (7.8/20) 和45% (18/40)。③改良方法純化的GXM對細(xì)胞的毒性作用：通過流式細(xì)胞儀檢測以改良法所獲得的H99GXM(刺激終濃度100 μg/mL)與小鼠脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)20 h后小鼠CD3+T淋巴細(xì)胞活性比值，結(jié)果提示小鼠CD3+T淋巴細(xì)胞大部分存活(見圖5，P3=99.7%)。

3 討 論

莢膜多糖在隱球菌逃逸機(jī)體的免疫殺滅過程中發(fā)揮了重要作用，且GXM也可誘導(dǎo)人體免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子TNF-α 和IFN-γ促進(jìn)機(jī)體清除[4]。因此有關(guān)GXM的生物學(xué)功能尚有爭議，需要進(jìn)一步研究[5-6]。而如何便捷地分離和純化GXM是進(jìn)一步研究它的生物學(xué)功能的前提條件。

根據(jù)Cherniak[2]和Wozniak[1]的提取方法，在提取GXM過程中所得到的GXM及GalXM混合莢膜多糖溶液不可避免混雜有少量隱球菌菌體。為此，我們使用0.8 μm及0.2 μm無菌針頭式過濾器先后過濾該混合莢膜多糖溶液，從而完全去除隱球菌菌體避免它對GXM純化后期過程的干擾。

由于GXM-CTAB復(fù)合物不易溶解于水，傳統(tǒng)GXM提取方法后期至少需要透析1周時(shí)間，使得GXM整個(gè)純化過程需耗時(shí)2周。本方法以24∶1氯仿：異戊醇混合液分離GXM-CTAB復(fù)合物，利用CTAB易溶于異戊醇有機(jī)溶劑中，而GXM易溶于水，離心分層后GXM位于水相、CTAB處于有機(jī)相使GXM-CTAB復(fù)合物快速分離。最后加入3倍體積的異丙醇沉淀出GXM。本研究以24∶1氯仿：異戊醇混合液替代透析法來分離GXM-CTAB復(fù)合物，這一改良步驟目前國內(nèi)外研究均未見報(bào)道。此外，由于改良的純化方法避免了透析1周這一費(fèi)時(shí)步驟，整個(gè)提取過程耗時(shí)從原來的14 d縮短為8 d。

H99GXM和R265GXM獲得率分別為39% (7.8/20)和45% (18/40)，由此推算從每升H99和R265菌株培養(yǎng)上清液中可分別獲得31 mg和72 mg GXM，獲得率與國內(nèi)外學(xué)者李平[3]和Cherniak[2]報(bào)道相一致。這表明本研究采用的GXM改良純化法與傳統(tǒng)方法的提取效率相當(dāng)。而且，以改良法所獲得的H99GXM(刺激終濃度100 μg/mL)與小鼠脾細(xì)胞體外共培養(yǎng)20 h，并沒有引起小鼠CD3+T淋巴細(xì)胞調(diào)亡。

圖2混合莢膜多糖溶液印度墨汁染色圖3傳統(tǒng)方法提取的GXM刺激小鼠脾細(xì)胞。a.流式細(xì)胞散點(diǎn)圖；b.7-aminoactinomycin D (7-AAD)染色;c.APC-CD3染色(P1.T淋巴細(xì)胞;P2. alive 7-AAD stained cells;P3.CD3陽性T淋巴細(xì)胞)圖4葡萄糖濃度(Y)與OD450值(X)標(biāo)準(zhǔn)曲線(苯酚硫酸法)圖5改良法提取的GXM刺激小鼠脾細(xì)胞。a.流式細(xì)胞散點(diǎn)圖;b.7-aminoactinomycin D (7-AAD)染色;c.APC-CD3染色(P1.T淋巴細(xì)胞;P2.alive 7-AAD stained cells;P3.CD3陽性T淋巴細(xì)胞)

Fig.2Mixed capsular polysaccharide solutionwith India ink stainingFig.3Stimulation of mouse splenocytes using GXM extracted by traditional methodFig.4Standard curve of glucose concentration (Y) and OD450value (X) made by phenol sulfuric acid methodFig.5Stimulation of mouse splenocytes using GXM extracted by modified method

本研究采用的GXM改良純化法不僅與傳統(tǒng)方法的提取效率相當(dāng)，而且使提取過程更佳簡單，耗時(shí)減少。由于本研究屬于探索式研究，所以存在樣本量較少，且通過流式細(xì)胞學(xué)檢測不足以了解GXM對細(xì)胞的毒性作用，所以我們接下來將通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以了解GXM對細(xì)胞的毒性作用。