周東 何艷平 李恒平 黃衛(wèi)東

環(huán)指蛋白Efp(estrogen-responsive ring finger protein，Efp)是RBCC(Ring-finger B-box coild-coil)家族的主要成員，其生物結(jié)構(gòu)包括一個環(huán)指區(qū)域、兩個B盒區(qū)域、一個螺旋狀卷曲區(qū)域以及一個C末端的SPRY區(qū)域[1]。Efp是雌激素受體(estrogen receptor)的靶點(diǎn)基因，在生物體內(nèi)子宮、腎臟、腦及肝臟等多器官中表達(dá)，同時與細(xì)胞多種生物功能調(diào)節(jié)有關(guān)，其中包括細(xì)胞周期、凋亡及腫瘤生成等[2]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，Efp與腫瘤細(xì)胞的異常病理活動密切相關(guān)，Efp基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。但是，目前對Efp與肝癌細(xì)胞的相關(guān)研究鮮有報道，其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制尚未清楚。本研究采用RNA干擾對人肝細(xì)胞株Bel7404進(jìn)行Efp基因沉默，探討Efp基因沉默對肝癌細(xì)胞Bel7404的增殖及侵襲力的作用機(jī)制，以期為相關(guān)的臨床治療提供新的可能性。

資料與方法

一、材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株Bel7404購買自美國菌種保藏中心。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購買自美國Hyclone公司。脂質(zhì)體LipofectaminTM 2000的轉(zhuǎn)染試劑盒購買自美國Invitrogen公司，質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒購買自美國TIANGEN公司。兔抗鼠多克隆抗體Efp購買自Santa Cruz公司，兔抗鼠多克隆抗體CyclinE和CDK2均購買自中國Proteintech公司。細(xì)胞增殖活性檢測MTT試劑盒、Transwell小室和BCA蛋白定量試劑盒均購買自中國Beyotime公司。

二、試驗方法

(一)Efp干擾質(zhì)粒的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中Efp基因序列，使用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)設(shè)計軟件，合成的siRNA序列為5’-GGUCCACCUGAUGUAU-AAGCUUAUACAUCAGGUGGAC-3’；同時陰性對照鏈為3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’。siRNA合成交由武漢晶賽生物工程公司完成。

(二)細(xì)胞培養(yǎng) 將冷存與液氮中的人肝癌細(xì)胞株Bel7404復(fù)蘇后，接種在含有100U/ml的青霉素與100ug/mL的鏈霉素、10%胎牛血清以及DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，然后將其置于37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2-3天進(jìn)行細(xì)胞換液，待細(xì)胞長滿至80%以上，采用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代后接種在新的培養(yǎng)皿中。

(三)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 本研究設(shè)立對照組(Control)和轉(zhuǎn)染組(siRNA)，對照組采用陰性對照鏈的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染組再用Efp的siRNA干擾質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時每組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔，細(xì)胞鋪滿孔內(nèi)80%以上后采用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染首先采用無血清DMEM培養(yǎng)基6 h，然后再將培養(yǎng)基換為10%胎牛血清后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其余過程均按照說明書指示進(jìn)行。

(四)Western blot檢測蛋白表達(dá) 將兩組細(xì)胞加入蛋白裂解液后提取總蛋白，采用BCA方法檢測蛋白濃度后，將總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離、NC膜轉(zhuǎn)膜、5%牛奶封閉1 h后，分別進(jìn)行Efp、CyclinE、CDK2和β-actin一抗4℃孵育過夜。次日進(jìn)行TBST洗膜三次后，再加入二抗室溫孵育1 h，暗室加入ECL試劑盒顯影記錄結(jié)果。

(五)細(xì)胞增殖能力檢測 首先將細(xì)胞接種于96孔中，每孔約1×104個，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞24、48和72 h時，每孔加入MTT液10 μL，然后再將培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h后去除上清液，加入DMSO液體孵育10 min后進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度，計算每組細(xì)胞的增殖能力。

(六)細(xì)胞侵襲力檢測 將轉(zhuǎn)染前后的Bel7404細(xì)胞接種無血清DMEM上室后，將含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于下室，待細(xì)胞培養(yǎng)24 h后取出小室，此刻細(xì)胞已經(jīng)遷移至上室膜的底面，將小室進(jìn)行4%多聚甲醛固定15 min后，采用結(jié)晶紫染色5～8 min，最后將其置于顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量定量分析。

(七)統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析，兩組間的比較采用t檢驗，計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染siRNA對Efp蛋白表達(dá)的影響

圖1結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞株Bel7404的siRNA組中Efp蛋白表達(dá)為0.32±0.05，較對照組的1.00±0.00明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，P<0.05)，此結(jié)果提示siRNA對人肝癌細(xì)胞株Bel7404體外轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞中的Efp基因表達(dá)可被干擾siRNA沉默，具體見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后Efp蛋白的表達(dá)；A: Bel7404細(xì)胞各組中Efp蛋白表達(dá)

二、轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒對細(xì)胞增殖及其機(jī)制的影響

圖2結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞株Bel7404中siRNA組的細(xì)胞增殖率在24、48和72h時為0.087±0.010、0.107±0.013以及0.120±0.010，分別較對照組的增殖率0.112±0.012、0.134±0.011以及0.163±0.010明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2A，P<0.05)。該結(jié)果提示肝癌細(xì)胞株在沉默Efp后可明顯抑制細(xì)胞增殖能力，而且呈時間依賴性，為進(jìn)一步深入研究Efp對細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，本研究進(jìn)而檢測細(xì)胞周期標(biāo)志蛋白CyclinE和CDK2的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，siRNA組中細(xì)胞的CyclinE和CDK2蛋白表達(dá)為0.47±0.04和0.27±0.12，分別較對照組明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B，P<0.05)，此結(jié)果提示Efp可通過抑制細(xì)胞周期蛋白CyclinE和CDK2的表達(dá)進(jìn)而阻礙肝癌細(xì)胞株的過度增殖，具體見圖2。

三、轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒對細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞株Bel7404的siRNA組中細(xì)胞侵襲率為0.3384±0.0492，顯著低于對照組的0.7057±0.0836，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.35，P<0.05)，此結(jié)果提示Efp可明顯抑制人肝癌細(xì)胞株的過度侵襲能力。

圖2轉(zhuǎn)染后Efp對Bel7404增殖及其機(jī)制的影響 A: 各組Bel7404細(xì)胞中不通時間點(diǎn)的增殖能力；B: Bel7404細(xì)胞各組中CyclinE和CDK2蛋白表達(dá)；*與對照組(Control)比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

討 論

Efp基因作為機(jī)體內(nèi)泛素連接酶E3調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的生長、增殖及分化等生物功能[4]。已有研究證明Efp可調(diào)節(jié)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，但是主要的研究多集中在乳腺癌或子宮內(nèi)膜癌的病理活動或預(yù)后發(fā)展[2]，關(guān)于Efp在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究較少。

研究表明Efp沉默可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞血管生成，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜癌的增殖及遷移[2]。而肝細(xì)胞癌癥多為血管富集性腫瘤，其腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移都與血管生成有著緊密的聯(lián)系[5-6]。根據(jù)肝臟腫瘤與血管生成緊密相連的病理機(jī)制以及過往的研究的結(jié)果，本研究通過采用Efp基因沉默，進(jìn)一步研究其余肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲力的關(guān)系。本研究選取人肝癌細(xì)胞株Bel7404作為研究對象，在此基礎(chǔ)沉默Efp表達(dá)，進(jìn)一步檢測其對細(xì)胞增殖及其侵襲力的影響機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，Bel7404細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA后，Efp蛋白表達(dá)明顯下降，這一結(jié)果說明病毒已轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中并成功使Efp基因沉默。而進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，Efp基因沉默后24、48以及72 h Bel7404的細(xì)胞增殖率明顯降低，并且呈時間依賴性。同時，實驗研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)沉默后Efp可明顯抑制細(xì)胞株的侵襲能力。關(guān)于細(xì)胞增殖作用機(jī)制，其中細(xì)胞周期標(biāo)志蛋白CyclinE和CDK2是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要調(diào)控細(xì)胞由G1期過渡至S期，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]。結(jié)合相關(guān)理論及前期實驗，為探討Efp對人肝癌細(xì)胞增殖及侵襲力的具體機(jī)制，本研究通過檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Efp基因沉默后可明顯降低細(xì)胞中周期蛋白CyclinE和CDK2的表達(dá)，這可能是Efp調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。而Efp可作為泛素連接酶E3，特異識別相關(guān)蛋白后促進(jìn)其在泛素途徑內(nèi)降解。根據(jù)我們研究結(jié)果和以往的研究，我們認(rèn)為Efp主要是通過靶向識別細(xì)胞周期標(biāo)志蛋白CyclinE和CDK2后，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白在肝癌細(xì)胞內(nèi)的降解，進(jìn)而通過阻滯細(xì)胞從G1期過渡至S期以達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力的目的。

綜上所述，本研究通過基因沉默Efp驗證其通過加速CyclinE和CDK2的降解，進(jìn)一步可調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞株Bel7404的增殖及侵襲能力，為肝癌治療開辟新的靶點(diǎn)，同時為后續(xù)研究提供了很多理論依據(jù)。