楊藝琳，張正敏，李美琳，趙立艷，金 鵬，鄭永華*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

葡萄屬于非呼吸躍變型果實(shí)，口味酸甜，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是夏季最常食用的水果之一。夏季屬于高溫多雨季節(jié)，空氣潮濕，加上運(yùn)輸、貯藏不當(dāng)導(dǎo)致的果實(shí)表面機(jī)械損傷，容易使葡萄采后遭受病原菌的侵染，從而造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）病原菌引起的灰霉病是葡萄果實(shí)采后最重要的病害之一[1]?？刂破咸鸦颐共〉膫鹘y(tǒng)方法是SO2熏蒸結(jié)合低溫保藏法，但葡萄果實(shí)對(duì)SO2非常敏感，劑量稍不適宜，就容易發(fā)生漂白、風(fēng)味劣變等傷害。除此之外，SO2容易在果皮表面殘留，并對(duì)人體健康產(chǎn)生致癌和致畸的危害，過(guò)量的SO2進(jìn)入空氣中還會(huì)造成環(huán)境污染[2]。因此迫切需要研究葡萄果實(shí)非SO2處理的綠色保鮮技術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)采用各種激發(fā)子處理誘導(dǎo)提高果蔬的抗病性，從而控制采后病害發(fā)生的研究較為廣泛。植物誘導(dǎo)抗病性主要有系統(tǒng)獲得抗性（system acquried resistance，SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性兩種形式[3]，按照作用機(jī)制誘導(dǎo)抗病性又可分為直接誘導(dǎo)作用和敏化反應(yīng)（Priming）機(jī)制。Priming機(jī)制表現(xiàn)為植物經(jīng)過(guò)激發(fā)子處理后不會(huì)直接展現(xiàn)任何可測(cè)的生理生化反應(yīng)，而只在受到病原菌侵染后才展現(xiàn)出更強(qiáng)、更快的抗病防衛(wèi)反應(yīng)，包括活性氧迸發(fā)、病程相關(guān)蛋白（pathogensis-related protein，PRs）基因強(qiáng)烈表達(dá)等[4]。這樣的防衛(wèi)機(jī)制能夠有效避免植物在未受到病原菌侵染因抵抗激發(fā)子脅迫產(chǎn)生抗病反應(yīng)而導(dǎo)致的物質(zhì)和能量消耗，因此是一種低成本、高效的抗病防御機(jī)制。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）和茉莉酸甲酯處理可有效誘導(dǎo)桃、楊梅、葡萄和櫻桃等采后果實(shí)遭受病原菌侵染后的Priming抗病反應(yīng)[5-8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸處理也是通過(guò)Priming機(jī)制誘導(dǎo)提高梨果實(shí)抗病性，從而減少青霉病的發(fā)生[9]。

油菜素內(nèi)酯（brassinosteroids，BRs）是一種天然的植物激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用[10]，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)生物和非生物脅迫的抗性能夠表現(xiàn)出獨(dú)特的生物效應(yīng)。在采后果蔬的研究中發(fā)現(xiàn)，外源BRs處理可以提高茄子[11]和草莓[12]果實(shí)的耐貯性和貯藏品質(zhì)，減輕青椒[13]、桃[14]、杏[15]和香蕉[16]果實(shí)貯藏冷害的發(fā)生，但BRs處理對(duì)果實(shí)抗病性誘導(dǎo)作用的研究較少。Zhu Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)5 μmol/L外源BRs處理可提高棗果實(shí)苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等幾種抗病相關(guān)酶的活性，降低采后青霉病的發(fā)病率，且其對(duì)離體青霉菌沒(méi)有直接的抑制作用。外源BRs處理也能夠激活柑橘果實(shí)水楊酸誘導(dǎo)的SAR途徑，表現(xiàn)為H2O2大量積累和PR基因顯著表達(dá)，從而降低采后腐爛率并保持品質(zhì)[18]。Liu Qing等[19]發(fā)現(xiàn)外源BRs處理對(duì)紅地球葡萄采后灰霉病有顯著的抑制作用，且能保持良好的貯藏品質(zhì)，但BRs處理抑制葡萄采后灰霉病的作用機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)以‘巨峰’葡萄為實(shí)驗(yàn)材料，采用2,4-表油菜素內(nèi)酯（2,4-epibrassionolide，EBR）處理果實(shí)，研究EBR處理對(duì)葡萄果實(shí)采后灰霉病的抑制作用，并從抗病相關(guān)酶活力和抗病相關(guān)基因表達(dá)的角度探討EBR誘導(dǎo)抗病的可能機(jī)理，為EBR處理在葡萄果實(shí)采后保鮮應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為‘巨峰’葡萄果實(shí)（Vitis vinifera L. ×V. labrusca L. cv. ‘Kyoho'），2017年8月采摘于江蘇省鎮(zhèn)江市句容丁莊葡萄園，采后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將果穗攤開后置于室溫散去田間熱，仔細(xì)剪下果粒并保留3～5 mm果梗，挑選色澤統(tǒng)一、成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲害的果粒以備實(shí)驗(yàn)。

病原菌B. cinerea來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保存完好的斜面菌種，經(jīng)PDA培養(yǎng)基分離純化二代（每代26 ℃恒溫培養(yǎng)14 d）后，用含體積分?jǐn)?shù)0.01% Tween-80的無(wú)菌水沖洗平板稀釋得到1×105個(gè)/mL濃度的孢子懸浮液（用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），置于4 ℃冰箱保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

EBR溶液配制：稱取一定量EBR溶解于1 mL、體積分?jǐn)?shù)98%乙醇溶液中，并加入一定量Tween-80，使其體積分?jǐn)?shù)為0.1%，即得到母液，將母液進(jìn)行梯度稀釋即可得到所需濃度的EBR溶液，保證乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為0.1%。

EBR、L-苯丙氨酸、氮藍(lán)四唑、核黃素、L-蛋氨酸、昆布多糖、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB） 上海瑞永生物科技有限公司；幾丁質(zhì)、亞精胺、Tris 美國(guó)Sigma公司；β-巰基乙醇、四氯化鈦、碳酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、硼酸、對(duì)二甲氨基苯甲醛、三水合乙酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；30% H2O2、福林-酚試劑、DEPC處理水 南京杰汶達(dá)生物科技有限公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒 日本TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600型分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；H1850R型冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；NanoDrop 2000分光光度計(jì)、SL 16R型冷凍離心機(jī)、MicroCL 21型微量離心機(jī)、QuantStudio? 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）系統(tǒng) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；MyCycler普通PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BSA124S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HZ-9211KB型恒溫振蕩器 太倉(cāng)市科教器材廠；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠；CX22型光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將挑選好的葡萄果粒整齊擺放在塑料白盒（330 mm×220 mm×60 mm）中，先用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，待乙醇揮發(fā)干凈后用滅菌移液槍頭在果實(shí)赤道中心部位穿刺打孔（直徑1.5 mm、深2 mm），用吸水紙小心吸去流出汁液，然后將葡萄果實(shí)隨機(jī)分成4 組進(jìn)行以下處理：1）對(duì)照組：用移液槍注入20 μL無(wú)菌蒸餾水后，于25 ℃放置12 h；2）EBR處理組：用移液槍注入20 μL 5 μmol/L EBR溶液后，于25 ℃放置12 h（前期預(yù)實(shí)驗(yàn)采用0、1、5、10 μmol/L EBR溶液處理葡萄果實(shí)，然后接種灰霉病原菌，發(fā)現(xiàn)抑制葡萄果實(shí)腐爛最適宜的EBR處理濃度為5 μmol/L，故選用此濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）；3）B. cinerea接種組：用移液槍注入20 μL無(wú)菌蒸餾水后，于25 ℃放置12 h，再用移液槍注入15 μL濃度為1×105個(gè)/mL的B. cinerea孢子懸浮液；4）EBR+B. cinerea接種組：用移液槍注入20 μL 5 μmol/L EBR溶液后，于25 ℃放置12 h，再接種15 μL 1×105個(gè)/mL的B. cinerea孢子懸浮液。4 組處理完成后，用兩層聚乙烯保鮮膜密封白盒，置于25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%的恒溫恒濕箱中貯藏60 h，每隔12 h記錄一次發(fā)病率和病斑直徑，同時(shí)取除去發(fā)病組織的健康果肉，快速剁碎混勻后隨機(jī)取一部分用液氮速凍后置于－80 ℃保存，作為qPCR樣品用于測(cè)定基因表達(dá)；剩下部分用保鮮膜包成條狀，用液氮速凍后置于－20 ℃保存，作為凍樣用于測(cè)定酶活性等指標(biāo)。重復(fù)3 次，每組約500 個(gè)果實(shí)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 發(fā)病率及病斑直徑測(cè)定

用游標(biāo)卡尺測(cè)量葡萄果實(shí)接種部位病斑直徑，大于1.5 mm則記為發(fā)病。發(fā)病率按下式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.2.2 體外孢子萌發(fā)率及芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度測(cè)定

參照Wang Kaituo等[20]方法稍作修改，吸取200 μL B. cinerea孢子菌懸液，加入到含5 mL PDB培養(yǎng)液（含5 μmol/L EBR）的無(wú)菌玻璃管中，使病原菌孢子最終濃度為1×105個(gè)/mL，以不含EBR的作為對(duì)照管。將試管放入恒溫?fù)u床（25 ℃、100 r/min）中培養(yǎng)36 h，每隔12 h用CX22型光學(xué)顯微鏡觀察并記錄病原菌的孢子萌發(fā)率和芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度（以芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度大于或等于孢子直徑時(shí)記為孢子萌發(fā)）。每組處理重復(fù)3 次，每次重復(fù)觀察100 個(gè)孢子。

1.3.2.3 幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的測(cè)定

幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力測(cè)定參照Abeles等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取2 g果實(shí)凍樣，用5 mL 0.1 mol/L pH 5.2的乙酸-乙酸鈉緩沖液（含1 g/L抗壞血酸和5 mmol/L β-巰基乙醇）冰浴研磨勻漿來(lái)提取粗酶液。幾丁質(zhì)酶活力通過(guò)測(cè)定水解產(chǎn)生N-乙酰葡萄糖胺的量來(lái)反映，以每分鐘反應(yīng)液在524 nm波長(zhǎng)處吸光度增加0.001為一個(gè)幾丁質(zhì)酶活力單位（U）。β-1,3-葡聚糖酶活力根據(jù)生成還原糖的量測(cè)定，以每小時(shí)生成1 mg葡萄糖為1 個(gè)β-1,3-葡聚糖酶活力單位（U）。單位為U/g，結(jié)果以濕質(zhì)量計(jì)。

1.3.2.4 PAL活力、總酚含量的測(cè)定

PAL活力的測(cè)定參照Assis等[22]方法稍作修改，反應(yīng)體系由50 mmol/L pH 8.8硼酸緩沖液（2.5 mL）、40 mmol/L L-苯丙氨酸（0.5 mL）和上清液（1 mL，由提取到的粗酶液離心后得到）組成，在37 ℃條件下水浴反應(yīng)80 min，以每小時(shí)290 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)PAL活力單位（U），單位為U/g。總酚含量根據(jù)Folin-Ciocalteu法[23]測(cè)定，用體積分?jǐn)?shù)80%丙酮（含體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸）提取粗酶液，單位為mg/100 g。結(jié)果均以濕質(zhì)量計(jì)。

1.3.2.5 活性氧代謝相關(guān)酶活力及H2O2生成量的測(cè)定

SOD活力測(cè)定參照Rao等[24]的方法，以抑制50%的NBT光還原反應(yīng)為一個(gè)酶活力單位（U）。CAT和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力分別參照Cakmak[25]和Nakano[26]等的方法稍作修改，于30 ℃下水浴10 min，以反應(yīng)液每分鐘在240 nm和290 nm波長(zhǎng)處吸光度降低0.01為一個(gè)酶活力單位（U），單位均為U/g。H2O2含量參照Patterson等[27]的方法測(cè)定，稱取2 g凍樣用5 mL 100%冷丙酮仔細(xì)研磨提取上清液，單位為μmol/g。結(jié)果均以濕質(zhì)量計(jì)。

1.3.2.6 抗病相關(guān)基因表達(dá)豐度的測(cè)定

葡萄果實(shí)總RNA用經(jīng)過(guò)修改的CTAB法[28]提取，取8 g左右葡萄果肉經(jīng)液氮充分研磨后加入到含10 mL CTAB（含體積分?jǐn)?shù)2% β-巰基乙醇，現(xiàn)用現(xiàn)配）提取液的離心管中，漩渦振蕩后置于65 ℃水浴中裂解40 min，12 000 r/min、4 ℃離心20 min取上清液，用等體積氯仿抽提2 次后加入1/4體積的10 mol/L LiCl3，4 ℃下沉淀過(guò)夜。13 000 r/min、4 ℃離心30 min后棄上清液，沉淀經(jīng)500 μL SSTE混合液（含1.0 mol/L NaCl、0.5 g/100 mL十二烷基硫酸鈉、10 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl和1 mmol/L乙二胺四乙酸，50 ℃預(yù)熱）洗脫后用氯仿再次洗脫2 次。得到的上清液加入兩倍體積無(wú)水乙醇，混勻后置于－20 ℃沉淀3 h，再次離心棄上清液，保證乙醇充分揮發(fā)，用DEPC處理水溶解后得到葡萄果實(shí)總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA質(zhì)量濃度，并通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，隨后用RNase-free水標(biāo)定RNA質(zhì)量濃度約為200 ng/μL，經(jīng)Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選擇葡萄果實(shí)的VvCHI、VvGNS和VvPAL-like3 個(gè)抗病相關(guān)基因進(jìn)行qPCR測(cè)定，其特異性引物根據(jù)NCBI設(shè)計(jì)得到（表1）。不同基因的表達(dá)水平用SYBR?Premix ExTaq?試劑盒進(jìn)行測(cè)定，所用cDNA經(jīng)過(guò)5 倍體積稀釋后取2 μL加入到20 μL反應(yīng)體系中。將Quant Studio?Real-Time PCR儀器程序設(shè)置為：初始反應(yīng)95 ℃、30 s，而后經(jīng)過(guò)95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s的40 個(gè)循環(huán)，最后通過(guò)95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s終止反應(yīng)。通過(guò)稀釋法分析最終擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線來(lái)評(píng)價(jià)引物的特異性。將反應(yīng)結(jié)果用閾值周期（Ct值）進(jìn)行歸一化處理，用2-ΔΔCt法[29]來(lái)表示目標(biāo)基因相對(duì)于管家基因（VvActin）的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 葡萄果實(shí)抗病相關(guān)基因特異性引物序列Table 1 Sequences of specific primers used for amplification of the genes associated with disease resistance in grape berries

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

果實(shí)病斑直徑重復(fù)測(cè)定10 次，其余指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性采用SAS 8.2軟件進(jìn)行Duncan's多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著。用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)病率與病斑直徑的影響

如圖1A所示，葡萄果實(shí)接種后發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，貯藏48 h內(nèi)EBR+B. cinerea接種組的發(fā)病率顯著低于B. cinerea接種組（P＜0.05），到貯藏終點(diǎn)60 h時(shí)兩組間發(fā)病率無(wú)顯著差異。如圖1B所示，病原菌侵染葡萄果實(shí)表面后病斑直徑不斷擴(kuò)展，整個(gè)貯藏期間EBR+B. cinerea接種組的病斑直徑均顯著低于B. cinerea接種組（P＜0.05）。在貯藏48 h和60 h時(shí)，EBR+B. cinerea接種組的病斑直徑分別僅為5.26 mm和6.76 mm，分別為B. cinerea接種組的53.71%和56.98%。這些說(shuō)明EBR處理可有效抑制葡萄果實(shí)接種B. cinerea后病害的擴(kuò)展。

圖1 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig. 1 Effect of EBR treatment on disease incidence (A) and lesion diameter (B) in grape berries inoculated with B. cinerea

2.2 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)體外孢子萌發(fā)率和芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度的影響

表2 EBR處理對(duì)B. cinerea孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度的影響Table 2 Effect of EBR treatment on spore germination and germ tube length of B. cinerea

如表2所示，B.cinerea經(jīng)體外培養(yǎng)12、24、36 h后，5 μmol/L的EBR處理顯著降低其孢子萌發(fā)率（P＜0.05），但對(duì)其芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度無(wú)顯著影響（P＞0.05）。說(shuō)明EBR處理對(duì)B.cinerea孢子萌發(fā)有一定抑制作用，但不直接抑制其芽管生長(zhǎng)。

2.3 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)抗病相關(guān)酶活力的影響

圖2 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)幾丁質(zhì)酶（A）和β-1,3-葡聚糖酶（B）活力的影響Fig. 2 Effect of EBR treatment and B. cinerea inoculation on the activities of chitinase (A) and β-1,3-glucanase (B) in grape berries

如圖2所示，貯藏前后對(duì)照組葡萄果實(shí)幾丁質(zhì)酶活力無(wú)明顯上升趨勢(shì)，而β-1,3-葡聚糖酶的活力呈不斷上升趨勢(shì)。單一EBR處理組果實(shí)的幾丁質(zhì)酶活力在貯藏48 h內(nèi)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而其β-1,3-葡聚糖酶的活力在整個(gè)貯藏期間與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。B. cinerea接種組和EBR+B. cinerea接種組果實(shí)在貯藏60 h內(nèi)幾丁質(zhì)酶活力均呈不斷上升的趨勢(shì)，其中EBR+B. cinerea接種組果實(shí)幾丁質(zhì)酶在貯藏12 h時(shí)就被快速激活，且其活力一直顯著高于其他3 組果實(shí)（P＜0.05）。B. cinerea接種組果實(shí)β-1,3-葡聚糖酶活力在貯藏48 h時(shí)達(dá)到峰值，而EBR+B. cinerea接種組果實(shí)則提前于36 h時(shí)達(dá)到峰值，且顯著大于單一EBR處理組（P＜0.05），貯藏期間EBR+B. cinerea接種組果實(shí)兩種酶活力在4 組中均為最高。這些結(jié)果說(shuō)明EBR處理能夠有效誘導(dǎo)葡萄果實(shí)接種B. cinerea后幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的上升。

2.4 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)PAL活力及總酚含量的影響

圖3 EBR處理和B. cinerea 接種對(duì)葡萄果實(shí)PAL活力（A）和總酚含量（B）的影響Fig. 3 Effects of EBR treatment and B. cinerea inoculation on PAL activity (A) and total phenolic content (B) in grape berries

如圖3所示，對(duì)照組果實(shí)的PAL活力和總酚含量在整個(gè)貯藏過(guò)程中均無(wú)明顯變化。單一EBR處理在貯藏36 h后顯著提高了總酚含量（P＜0.05），但在36 h之前對(duì)總酚含量無(wú)顯著影響。經(jīng)B. cinerea接種果實(shí)的PAL活力及總酚含量均在貯藏36 h達(dá)到峰值，分別為此時(shí)對(duì)照組的1.46、1.21 倍，隨后快速下降。先經(jīng)EBR處理后接種B. cinerea的葡萄果實(shí)PAL活力和總酚含量均在貯藏12～24 h時(shí)快速增加，在貯藏36 h時(shí)出現(xiàn)明顯峰值，分別為對(duì)照組的2.08、1.36 倍，并在之后的貯藏過(guò)程中顯著高于對(duì)照組果實(shí)（P＜0.05）。先經(jīng)EBR處理后接種B. cinerea組的總酚含量只在貯藏的前36 h顯著高于單一EBR處理組（P＜0.05），而36 h后兩組差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)活性氧代謝相關(guān)酶活力及H2O2生成量的影響

圖4 EBR處理和B. cinerea 接種對(duì)葡萄果實(shí)SOD（A）、CAT（B）、APX（C）活力和E2O2含量（D）的影響Fig. 4 Effects of EBR treatment and B. cinerea inoculation on SOD (A),CAT (B) and APX (C) activity and H2O2 content (D) in grape berries

H2O2是植物細(xì)胞中最主要的活性氧自由基，而SOD、CAT和APX則是清除植物細(xì)胞中活性氧自由基的3 種關(guān)鍵酶。由圖4A可知，先經(jīng)EBR處理后接種B. cinerea誘導(dǎo)了葡萄果實(shí)SOD活力的升高，使得貯藏期間EBR+B. cinerea接種組果實(shí)SOD活力顯著高于對(duì)照組和單一EBR處理組（P＜0.05）。

由圖4B、C可知，在整個(gè)貯藏期間，葡萄果實(shí)CAT和APX的活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，單一EBR處理顯著抑制了后期CAT和APX活力的下降，而EBR+B. cinerea接種組果實(shí)CAT和APX活力在貯藏前期就快速增長(zhǎng)，36 h時(shí)達(dá)到峰值后依然維持在較高水平直至貯藏結(jié)束。

由圖4D可知，貯藏期間對(duì)照組和單一EBR處理組葡萄果實(shí)的H2O2含量變化趨勢(shì)一致，整體呈緩慢上升趨勢(shì)，單一EBR處理可以緩慢提高H2O2生成量；而經(jīng)過(guò)EBR處理和未經(jīng)過(guò)EBR處理的葡萄果實(shí)在接種B. cinerea后其H2O2含量立刻增加，并在貯藏36 h出現(xiàn)明顯峰值，含量分別11.47 μmol/g和10.39 μmol/g，隨后不斷下降，這與CAT和APX活力變化一致。先經(jīng)EBR處理后接種B. cinerea使得葡萄果實(shí)H2O2含量在貯藏24 h之后均顯著高于單一B. cinerea接種組（P＜0.05），說(shuō)明EBR處理誘導(dǎo)了H2O2的生成和積累。

2.6 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)抗病相關(guān)基因表達(dá)豐度的影響

圖5 EBR處理和B. cinerea接種對(duì)葡萄果實(shí)VvCHI（A）、VvGNS（B）和VvPAL-like（C）基因表達(dá)豐度的影響Fig. 5 Effects of EBR treatment and B. cinerea inoculation on gene expression levels of VvCHI (A), VvGNS (B) and VvPAL-like (C) in grape berries

如圖5所示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)EBR處理不能顯著誘導(dǎo)貯藏前期葡萄果實(shí)VvCHI、VvGNS和VvPAL-like基因的表達(dá)，只在貯藏48 h后這些基因的表達(dá)水平才顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；B. cinerea接種處理可有效誘導(dǎo)VvCHI和VvPAL-like基因在貯藏24 h之后的表達(dá)，同時(shí)提高VvGNS基因在貯藏36 h之后的表達(dá)，其表達(dá)水平均顯著高于單一EBR處理組；經(jīng)EBR處理后再接種B. cinerea的果實(shí)中VvCHI、VvGNS和VvPAL-like基因表達(dá)豐度呈顯著上升的趨勢(shì)，在貯藏24 h之后均顯著高于單一EBR處理的果實(shí)（P＜0.05），并始終保持高表達(dá)，在貯藏結(jié)束時(shí)分別為對(duì)照組水平的14.98、4.90、16.20 倍。

3 討 論

BRs作為一種環(huán)境友好型化學(xué)激發(fā)子，在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L EBR處理能夠顯著抑制葡萄果實(shí)采后灰霉病的發(fā)病率和病斑直徑的擴(kuò)展，同時(shí)體外研究表明5 μmol/L EBR處理可顯著抑制B. cinerea孢子的萌發(fā)，但對(duì)芽管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度沒(méi)有顯著影響，這些結(jié)果說(shuō)明EBR處理除了直接的抑菌作用外，很可能誘導(dǎo)提高了葡萄果實(shí)的抗病性，從而抑制果實(shí)灰霉病的發(fā)生。這與BABA處理對(duì)葡萄果實(shí)灰霉病影響的結(jié)果[31]相似。Zhu Zhu等[17]在棗果實(shí)上發(fā)現(xiàn)BRs對(duì)青霉菌沒(méi)有體外抑菌效果，這可能是不同病原菌對(duì)BRs敏感性不同造成的。

當(dāng)植物受到病原菌侵染后，會(huì)在感染部位誘導(dǎo)和積累大量PR蛋白使SAR，這就包括幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶[32]，兩者共同作用于真菌細(xì)胞壁使其失去活力。PAL是苯丙烷代謝途徑中的第一關(guān)鍵酶，與酚類物質(zhì)和植保素合成密切相關(guān)，這兩者的合成在抗病反應(yīng)中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)和未經(jīng)過(guò)EBR處理的接種組果實(shí)PAL活力與總酚含量變化趨勢(shì)趨于一致，PAL活力升高的同時(shí)酚類物質(zhì)大量生成，而酚類化合物具有直接抗真菌的能力，有利于形成一道抵抗病原菌侵入的屏障。說(shuō)明EBR處理通過(guò)誘導(dǎo)PAL活力及總酚含量來(lái)增強(qiáng)果實(shí)抗病性，這與EBR在杏[15]中的研究結(jié)果一致。另外，單一EBR處理在貯藏前期不能顯著誘導(dǎo)VvCHI、VvGNS和VvPAL-like基因表達(dá)，但隨著貯藏后期發(fā)病率的升高，基因表達(dá)豐度明顯上升。而EBR+B. cinerea接種處理則較單一EBR處理或B. cinerea接種處理更顯著地誘導(dǎo)了抗病基因的表達(dá)，使得幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和PAL活力在整個(gè)貯藏期間都維持在最高水平。這些結(jié)果表明EBR處理可誘導(dǎo)提高采后葡萄果實(shí)的抗病性，且只在病原菌侵染后才表現(xiàn)出更強(qiáng)、更快的抗病反應(yīng)，說(shuō)明EBR是通過(guò)Priming機(jī)制誘導(dǎo)葡萄果實(shí)的抗病性，從而有效抑制灰霉病的發(fā)生，這與BABA處理誘導(dǎo)草莓果實(shí)抗病性的結(jié)果[33]一致。

活性氧迸發(fā)是植物抵抗病原菌侵染的重要防衛(wèi)反應(yīng)，其中H2O2可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)系統(tǒng)的抗性，同時(shí)激活抗氧化相關(guān)酶活力和PR基因表達(dá)，而H2O2含量受到SOD、APX、CAT等活性氧代謝酶調(diào)控，其中CAT和APX可以協(xié)同清除H2O2。已有研究證實(shí)H2O2作為信號(hào)分子在EBR誘導(dǎo)抗性中發(fā)揮著重要作用，其持續(xù)的高含量提高了生物體抵抗病原菌入侵的應(yīng)激防御能力[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)接種的EBR處理可以緩慢提升整個(gè)貯藏期間H2O2含量，而當(dāng)接種B. cinerea后，H2O2含量立刻迸發(fā)，并在36 h達(dá)到高峰，并且EBR+B. cinerea接種組果實(shí)H2O2含量在整個(gè)貯藏期間都保持最高水平。這揭示了EBR通過(guò)誘導(dǎo)H2O2積累來(lái)提高葡萄果實(shí)抗病性。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EBR處理提高了SOD、APX和CAT活力，且在面對(duì)病原菌侵入時(shí)顯著增加，與Cao Shifeng等[36]的研究結(jié)果一致。說(shuō)明貯藏前期高濃度H2O2誘導(dǎo)活性氧代謝酶活力升高以清除過(guò)量活性氧，而貯藏后期H2O2含量呈下降趨勢(shì)，但依然保持高水平，延緩了活性氧代謝酶活力的下降，從而保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，這與在柑橘[18]中的研究結(jié)果一致。因此，推測(cè)H2O2可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子對(duì)EBR誘導(dǎo)葡萄果實(shí)抗病性起關(guān)鍵作用。

綜合以上研究結(jié)果表明，經(jīng)5 μmol/L EBR處理的葡萄果實(shí)不立刻展現(xiàn)強(qiáng)烈的抗病性，只有受到病原菌脅迫時(shí)才會(huì)展現(xiàn)出更為強(qiáng)烈的抗病反應(yīng)，包括活性氧迸發(fā)、總酚含量和抗病相關(guān)酶活力升高及PR基因表達(dá)水平增加等，這符合Priming機(jī)制的典型特征。因此推測(cè)EBR處理主要是通過(guò)Priming機(jī)制誘導(dǎo)提高葡萄果實(shí)的抗病性，從而抑制灰霉病的發(fā)生。