沈旭丹，吉夢馨，翟齊嘯，趙建新，張 灝，田豐偉*，陳 衛(wèi)

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

功能性便秘是一種臨床上常見的胃腸道疾病[1]。美國2011年流行病學調查發(fā)現(xiàn)，便秘在全世界的平均發(fā)病率為16%，其中中國約有20%～30%的人口受到便秘困擾[2]。功能性便秘的發(fā)病率逐年上升，且易受飲食、環(huán)境、情緒等多種因素影響，其中老年人發(fā)病率高于青壯年[3]，女性患者多于男性[4]，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為排便困難、次數(shù)少（頻率低于3 次/周），糞便干硬，常伴有腹痛、腹脹等癥狀，一般慢性便秘的病程長達6 個月[5]。便秘的發(fā)生一般伴隨著腸道動力及菌群失調，相關發(fā)病機制主要包括：膳食纖維、水分攝入較少或濫用刺激性瀉藥，腸道敏感性降低；腫瘤等疾病壓迫腸道，腸蠕動受機械性阻礙；腸平滑肌張力降低，排便肌群活動障礙，蠕動減弱[6]；腸道菌群紊亂[7]。有研究表明，便秘患者普遍存在焦慮、抑郁情緒，間接影響其在社會關系等領域的生活質量[8]。此外，長期便秘將會導致腸壁損傷，腸道中毒素聚集堆積，從而引起一系列全身性并發(fā)癥[9]。功能性便秘的個體差異較大，目前醫(yī)學上主要以針對緩解排便困難等癥狀，促進恢復正常的腸道動力為治療目標，而市場上應用于治療便秘以西藥瀉劑居多，諸如容積性瀉劑、滲透性瀉劑等，但瀉劑對于便秘患者適用性較為局限，且容易產生藥物依賴性，長期服用會出現(xiàn)諸如腹脹、維生素吸收障礙等各種類型的副作用[10]。

益生菌是指給予（攝入）充足的數(shù)量能對宿主產生一種或多種特殊且經(jīng)臨床論證的功能性健康益處的活的微生物[11]，主要包括乳桿菌、雙歧桿菌等。研究表明，某些益生菌的攝入，能產生細菌素有效抑制病原菌的生長繁殖，從而改善腸道菌群的結構以及緩減堆積的酚類物質的危害[12]；此外，益生菌能產生大量的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），降低結腸的pH值和傳輸時間，從而促進腸道蠕動[13]。考慮到功能性便秘患者常伴有腸道菌群失調以及轉運速率變慢，通過益生菌緩解便秘的研究逐漸引起重視，同時市場上也已出現(xiàn)了針對緩減便秘的微生物制劑。

目前常見的微生態(tài)制劑如培菲康、麗珠腸樂、整腸生、金雙歧等，主要以混菌制劑較多，且以雙歧桿菌和芽孢桿菌多見。有研究顯示，植物乳桿菌、干酪乳桿菌等多種乳桿菌也具有調節(jié)腸道動力以及腸道菌群的功能，具有成為治療便秘的微生態(tài)制劑的潛力。一項關于便秘人群的臨床研究表明，服用植物乳桿菌SN13T制劑6 周后，便秘人群的排便次數(shù)顯著增加，糞便指數(shù)趨近于4（4為最易排便的分數(shù)）[14]。此外，曹永強[15]利用鹽酸洛哌丁胺建立便秘小鼠模型，發(fā)現(xiàn)攝入干酪乳桿菌N1115能促進和改善便秘小鼠的腸道推進率以及糞便質量，同時有效地緩解便秘導致的腸道損傷。

綜合乳桿菌潛在的益生功能，本研究通過體外相關評價指標，綜合考察了45 株來自泡菜或人類腸道的乳桿菌的生理特性，并對部分乳桿菌進行了抗生素耐藥性評價，綜合篩選出了3 株安全并具有優(yōu)良特性的乳桿菌進行調節(jié)腸道功能的體內評價，以期獲得具有調節(jié)腸道動力以及腸道菌群功能的乳桿菌，豐富益生菌資源庫，并為其后續(xù)在腸道功能紊亂及相關疾病上的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

乳桿菌均來源于江南大學生物技術中心菌種保藏庫，分別分離自發(fā)酵食品與健康人群新鮮糞便。菌株編號如下：LG1～LG4為格氏乳桿菌；LC5～LC13為干酪乳桿菌；LP14～LP22為植物乳桿菌；LB23～LB26為短乳桿菌；LB27～LB28為瑞士乳桿菌；LF29～LF39為發(fā)酵乳桿菌；LR40～LR45為鼠李糖乳桿菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司；ISO-sensitest（IST）培養(yǎng)基 英國OXOID公司；LSM培養(yǎng)基：采用900 mL IST培養(yǎng)基、100 mL MRS培養(yǎng)基配制。

1.1.3 主要試劑

活性炭粉末、胰蛋白酶（1∶250） 上海生工試劑有限公司；膽鹽 上海拜力生物科技有限公司；胃蛋白酶（1∶15 000） 美國Sigma公司；易蒙停鹽酸洛哌丁胺膠囊（2 mg） 西安楊森制藥有限公司；糞便樣品基因組提取試劑盒（Fast DNA SPIN Kit for Feces） 美國MP公司；超薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）天根生化科技（北京）有限公司；低聚果糖（fructo oligosaccharides，F(xiàn)OS）、低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS） 保齡寶生物股份有限公司；低聚木糖（xylo-oligosaccharides，XOS）（純度95%）上海源葉生物科技有限公司。

低聚果糖的主要組成為40%～54%蔗果五糖、40%～42%蔗果四糖、6%～8%蔗果三糖以及5%葡萄糖；低聚半乳糖的主要組成為16%～21%低聚半乳二糖、38%～51%低聚半乳三糖、25%～29%低聚半乳四糖到八糖以及7%～10%乳糖。

1.1.4 實驗動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康雄性BALB/c小鼠（生產許可證號：SCXK（滬）2018-0003），體質量為20～22 g。購于江蘇蘇普斯實驗動物中心。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫鼓風干燥箱、電熱恒溫水槽、HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；磁力攪拌器 德國IKA公司；真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司；VarioskanLUX多功能微孔板讀數(shù)儀、酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；GCMS-QP2100氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 日本島津公司；T100聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀、水平瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)、Universal hood II凝膠成像儀 美國伯樂公司；Milli-Q水凈化系統(tǒng) 密理博（中國）有限公司；DZQ500真空包裝機 上海翔一包裝機械有限公司；NanoPhotometer超微量紫外分光光度計 德國IMPLEN公司；FastPrep-24核酸快速提取儀 美國MP公司；MiSeq第二代高通量測序儀 美國Illumina公司；ZHJHC1115B型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌的體外特性篩選

1.3.1.1 乳桿菌的培養(yǎng)

將利用體積分數(shù)30%的甘油保存的乳桿菌劃線活化后，分別按體積分數(shù)2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，連續(xù)活化2 代后待用。

1.3.1.2 乳桿菌在模擬胃腸道中的耐受能力

模擬胃腸液的制備參考文獻[16]?；罨玫木暾{節(jié)菌液初始濃度至109CFU/mL，重懸于等體積模擬胃液中培養(yǎng)3 h，離心重懸于等體積模擬腸液中培養(yǎng)4 h，分別進行平板活菌計數(shù)，按照式（1）計算乳桿菌在耐酸耐膽鹽后的存活率。

式中：C為耐酸耐膽鹽后的菌液濃度/（CFU/mL）；C0為菌液初始濃度/（CFU/mL）。

1.3.1.3 乳桿菌利用低聚糖能力的測定

受試低聚糖為FOS、XOS和GOS。溴甲酚紫作為顯色劑，將活化后的菌液用生理鹽水重懸后點在含不同碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 h，觀察培養(yǎng)基變色情況[17-18]。

1.3.1.4 乳桿菌產SCFAs能力的測定

將活化好的菌株調節(jié)菌液初始濃度至2×108CFU/mL，菌液、10%硫酸以體積比25∶1混合酸化，加入4 倍10%硫酸體積的乙醚，振蕩混勻后，提取脂肪酸。18 000×g條件下離心15 min，分離上層乙醚相，并通過無水Na2SO4進行干燥；靜置30 min后，18 000×g條件下繼續(xù)離心5 min，用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析上層乙醚相中的SCFAs。GC-MS檢測條件參考文獻[17]中方法。

1.3.1.5 乳桿菌的抗生素耐受性評價

乳酸菌的抗生素安全性評價方法見參考文獻[19]。其中，鼠李糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）對照菌株為ATCC 334；植物乳桿菌、短乳桿菌的MIC對照菌株為ATCC 14917。

1.3.2 乳桿菌對小鼠腸道功能的調節(jié)實驗

1.3.2.1 灌胃菌株的制備

活化好的菌株洗滌3 次后重懸于12 g/100 mL的脫脂乳粉溶液中，－80 ℃保存。

1.3.2.2 動物實驗設計

參考文獻[20]，將120 只BALB/c雄性小鼠隨機分成10 組，每組12 只，分別為空白對照組（灌胃無菌生理鹽水）、3 株菌不同劑量的干預組（高、中、低劑量分別為1×1010、1×109、1×108CFU/kg mb，分別用H、M、L表示），灌胃15 d。實驗期間，飼養(yǎng)環(huán)境嚴格控制在溫度（25±2）℃、相對濕度（50±5）%、光照12 h和黑夜12 h的環(huán)境中，小鼠自由進食、進水。本動物實驗中所用的方法均經(jīng)過江南大學倫理委員會審閱并批準（JN.No20170930b1101105），并符合歐盟實驗動物指南（Directive 2010/63/EU）。

1.3.2.3 小鼠健康指標的測定

記錄實驗第0天和第15天小鼠的體質量、食物攝入量，實驗結束后按式（2）計算小鼠食物利用率。

1.3.2.4 小鼠小腸推進率以及首粒排黑便時間的測定

灌胃第15天晚小鼠禁食過夜，次日隨機給每組中6 只小鼠灌胃鹽酸洛哌丁胺（模型組），30 min后灌胃活性炭溶液，記錄小鼠的首粒排黑便時間。30 min后處死，測量小腸總長度，計量墨汁推進長度，按式（3）計算小腸推進率。

1.3.2.5 小鼠糞便水分質量分數(shù)以及SCFAs含量的測定

灌胃第15天上午收集每只小鼠的糞便，稱量并記錄每只小鼠糞便濕質量，干燥后記錄干質量，按式（4）計算糞便的水分質量分數(shù)。糞便中SCFAs含量的測定參考

1.3.1.4 節(jié)中的方法。

1.3.2.6 小鼠糞便菌群組成的測定

根據(jù)糞便試劑盒說明書提取小鼠糞便樣品中細菌基因組，并以此為模板，擴增16S rDNA的V4區(qū)，PCR驗證后進行切膠回收，回收產物按照Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒說明書進行定量。根據(jù)PicoGreen熒光染料的定量結果，按等質量濃度混合樣品，樣品之間barcode不重復；按照Illumina建庫試劑盒TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit說明書構建文庫，主要包括末端修復、3'端加A、接頭連接以及PCR擴增等步驟。文庫構建完成后，采用Bioanalyzer 2100儀測定DNA片段大??；按照KAPA Biosystems Library Quantification Kit試劑盒說明書，采用定量PCR法精確測定文庫的DNA質量濃度。上機測序前的準備工作、上機測序以及測序完成后下機數(shù)據(jù)處理參照文獻[21]中的方法進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)表示為每組數(shù)據(jù)的平均值±標準差，實驗均設有至少3 組平行，統(tǒng)計分析圖通過GraphPad Prism 5和Origin 8.5軟件完成。采用SPSS軟件中的單因素方差分析和Duncan's多量程檢驗對各組平均值的差異進行分析。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌的體外特性分析

2.1.1 乳桿菌在模擬胃腸道中的耐受能力

研究表明，益生菌對腸道功能的調節(jié)能力與其在腸道中的活菌數(shù)密切相關。Li Xiangfei等[22]分別用干酪乳桿菌死菌和活菌處理糖尿病小鼠，結果發(fā)現(xiàn)相較于死菌，活菌更加顯著地提高了小鼠腸道內SCFAs的濃度以及Akkermansia等有益菌的相對豐度，同時促進了糖尿病小鼠腸道內普遍偏少的L細胞的增殖，通過腸道相關功能的改善進一步緩減了糖尿病癥狀。因此，益生菌能否通過胃酸環(huán)境，繼續(xù)耐受腸道的高膽鹽，并以活菌形式到達小腸是其在腸道中發(fā)揮作用的前提。

本實驗參考了常用的模擬胃腸道方法，探究初始濃度均為2×108CFU/mL的不同乳桿菌在先耐受pH值為3.0的胃液3 h，繼續(xù)耐受含3 g/L膽鹽的腸液4 h后的存活情況。結果發(fā)現(xiàn)，不同乳桿菌的耐酸、耐膽鹽能力存在顯著差異，其中瑞士乳桿菌LB25最高，達到了34.18%，而最低的格氏乳桿菌LG1的存活率僅有0.15%。同時本實驗以標準菌株鼠李糖乳桿菌LGG作為耐酸、耐膽鹽實驗的標準參考，其耐酸、耐膽鹽后的平均存活率為6.35%，與Mandal等[23]測得LGG耐受0.3%膽鹽2 h后的平均存活率81%相差較大，而與Li Chun等[24]探究的凍干粉LGG在耐受等質量濃度的腸液4 h后的存活率為4.74%較為相近。通過實驗方法的比較，推測可能是由于Mandal等的實驗過程中采用MRS培養(yǎng)基作為膽鹽的載體，耐受環(huán)境營養(yǎng)豐富，適宜乳桿菌的生長，從而緩減了膽鹽對LGG的損傷程度。而Li Chun等實驗方案和結果與本實驗較為相似，也進一步表明本實驗結果的可信度。本實驗各菌株的耐酸耐膽鹽結果如圖1所示，在連續(xù)經(jīng)受胃液和腸液后，受試乳桿菌的存活率均顯著降低，僅有11 株乳桿菌的最終存活率在10%以上，其中LC9、LP17、LB25、LF38的存活率在20%以上，表現(xiàn)出了良好的耐酸、耐膽鹽能力。

圖1 乳桿菌耐酸耐膽鹽后的存活率Fig. 1 Tolerance of Lactobacillus to simulated gastric juice and intestinal juice

2.1.2 乳桿菌利用低聚糖特性的研究

FOS、GOS、XOS均為功能性低聚糖，此類低聚糖不能被機體吸收，乳桿菌如果能利用低聚糖，在腸道中快速生長繁殖，就能占領優(yōu)勢生態(tài)位，改變腸道菌群的結構，同時發(fā)酵產生SCFAs，調節(jié)結腸pH值，抑制致病菌的增殖[25]，此外還能促進礦物質吸收、脂肪代謝以及調節(jié)機體的免疫，有利于宿主的健康[26]。

表1 乳桿菌對低聚糖的偏好性Table 1 Preferential utilization of oligosaccharides by Lactobacillus

由表1可知，干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌以及鼠李糖乳桿菌普遍都能利用這3 種低聚糖，但個體之間存在一定的差異。乳桿菌代謝低聚糖時需要借助于轉運蛋白以及胞內糖苷酶的參與。Goh等[27]總結了4 種乳桿菌代謝FOS、GOS的不同途徑，指出不同種/株乳桿菌在代謝低聚糖時可能受轉運蛋白數(shù)量、ATP數(shù)量等因素的制約，從而解釋了本實驗中菌株之間對低聚糖利用能力的差異性。此外，G?nzle等[28]綜合了17 種乳桿菌中編碼4 類低聚糖代謝的基因分布，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌以及植物乳桿菌中相關代謝基因比較豐富，可能具有良好的低聚糖利用能力，這與本實驗結果一致。2.1.3 乳桿菌產SCFAs能力的研究

乳桿菌在體內發(fā)酵低聚糖產生SCFAs，主要為乙酸、丙酸、丁酸等。這些SCFAs參與機體相關代謝，能促進機體對某些電解質的吸收以及腸上皮細胞的增殖，調節(jié)腸道免疫，恢復胃腸道的完整性和功能性，間接干預其他生理效應[29]。因此，乳桿菌產SCFAs的能力也是評價其對腸道功能調節(jié)作用的一個重要指標。

圖2 不同乳桿菌產SCFAs能力的比較Fig. 2 Comparison of contents of short chain fatty acids produced by various Lactobacillus strains

圖4 不同乳桿菌產丙酸能力的比較Fig. 4 Comparison of contents of propionic acid produced by various Lactobacillus strains

圖5 不同乳桿菌產丁酸能力的比較Fig. 5 Comparison of contents of butyric acid produced by various Lactobacillus strains

由圖2～5可知，乙酸的產量占SCFAs總產量的絕大部分，其中所有的受試乳桿菌均可以產4 種SCFAs，但產酸能力具有差異性，格氏乳桿菌LG1（（3.20±0.50）mmol/L）、植物乳桿菌LP21（（3.60±0.38）mmol/L）、發(fā)酵乳桿菌LF37（（3.64±0.24）mmol/L）和鼠李糖乳桿菌LR45（（2.90±0.05）mmol/L）具有良好的產SCFAs能力。

2.1.4 乳桿菌的安全性評價

微生物對抗生素的耐受能力往往源于其固有耐藥性或獲得性耐藥性。其中，故有耐藥性為天然耐藥性，抗性基因位于染色體上，相對穩(wěn)定；而獲得性耐藥性主要是由基因的水平轉移產生，此類基因多位于質粒上，而質粒轉移的宿主范圍十分廣泛[30]。?t?epetova等[31]通過檢測腸道菌對多種不同抗生素的耐藥能力及其耐藥基因，進一步驗證了微生物的耐藥性可能來自于質粒。一般認為，腸道細菌若具有抗生素耐藥基因，且耐藥基因不穩(wěn)定，則可能通過水平轉移至致病菌，從而危害人體健康。有研究表明，極少數(shù)乳桿菌菌株的耐藥性基因是由質粒編碼的[32]，因此，評價乳桿菌的抗生素耐受性對其安全使用具有重要意義。

表2 不同乳桿菌的抗生素MIC（A）Table 2 Minimal inhibitory concentrations of antibiotics against various Lactobacillus strains (A)

表3 不同乳桿菌的抗生素MIC（B）Table 3 Minimal inhibitory concentrations of antibiotics against various Lactobacillus strains (B)

本實驗根據(jù)乳桿菌耐酸耐膽鹽、低聚糖利用及產SCFAs能力的結果，綜合選擇15 株生理性質較好的乳桿菌進行抗生素安全性評價，評價方法參考ISO 10932—2010。由表2、3可知，除發(fā)酵乳桿菌LF34外，其余14 株乳桿菌的抗生素安全性均符合要求，氯霉素MIC為1.30×10－7～20.00×10－7g/mL，紅霉素MIC為1.00×10－9～250.00×10－9g/mL，克林達霉素MIC為2.00×10－8～25.00×10－8g/mL，新霉素、鏈霉素和慶大霉素的MIC分別為2.50×10－7～80.00×10－7、5.00×10－7～80.00×10－7、2.50×10－7～20.00×10－7g/mL。與前人研究一致，受試乳桿菌對能夠抑制蛋白質合成的抗生素如氯霉素、紅霉素等較敏感[33]。

2.2 乳桿菌對小鼠腸道功能的調節(jié)作用

2.2.1 所選菌株對小鼠健康指標的影響

圖6 實驗期間小鼠的體質量增加量Fig. 6 Body mass gains of mice

圖7 實驗期間各組小鼠的食物利用率Fig. 7 Food utilization rates of mice

綜合考慮耐酸、耐膽鹽、低聚糖利用能力、產SCFAs能力以及抗生素耐受性，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌LC9、發(fā)酵乳桿菌LF37和鼠李糖乳桿菌LR45能在腸道中保持更好活性，因此，挑選這3 株菌進行研究。由圖6、7可知，各實驗組小鼠的體質量在實驗過程中略有上升，而除干酪乳桿菌LC9-L干預組的食物利用率低于空白組外，其余干預組的食物利用率均高于空白組，且組間并沒有顯著性差異，說明所選3 株乳桿菌灌胃15 d后對小鼠的健康無負作用。

2.2.2 所選菌株對小鼠腸道運動的影響

小腸推進率與首粒排黑便時間分別反映了小腸和整個腸道的運動能力。在腸道蠕動抑制模型造模過程中，與空白組相比，模型組小腸推進率顯著降低，首粒排黑便時間顯著延長，說明造模成功[21]。

由圖8、9可知，干酪乳桿菌LC9和發(fā)酵乳桿菌LF37這2 株菌的3 個劑量組小腸推進率均顯著高于模型組，以及首粒排黑便時間均顯著低于模型組，說明這2 株菌可以促進腸道蠕動，加速排便。而鼠李糖乳桿菌LR45改善腸道運動能力上具有濃度依賴效應。

圖8 灌胃結束后小鼠的小腸推進率Fig. 8 Small intestinal transition rates of mice after gavage

圖9 灌胃結束后小鼠的首粒排黑便時間Fig. 9 First black stool defecation time of mice after gavage

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》[20]中的評判標準，小腸推進率實驗與黑便實驗結果均為陽性即可判定干酪乳桿菌LC9、發(fā)酵乳桿菌LF37和鼠李糖乳桿菌LR45具有提高腸道動力/促進排便的保健功能。

2.2.3 所選菌株對小鼠糞便水分質量分數(shù)以及SCFAs含量的影響

糞便水分質量分數(shù)和SCFAs含量是評價糞便質量的2 個重要指標。大便干燥容易引起便秘，而SCFAs主要是由結腸內厭氧菌發(fā)酵碳水化合物產生，可以降低腸道pH值，增殖有益菌、抑制有害菌以調節(jié)腸道菌群，改善腸道功能[34]。王琳琳[21]將4 種SCFAs分別處理實驗小鼠，發(fā)現(xiàn)處理后小鼠血清中5-羥色胺分泌增加，腸道肌肉收縮、蠕動能力增強，結腸轉運速率加快。

圖10 灌胃第15天時小鼠的糞便水分質量分數(shù)Fig. 10 Defecation status of mice on Day 15 of intragastric administration

由圖10可知，各組小鼠的糞便形態(tài)和糞便水分質量分數(shù)均在正常范圍內，干預組干酪乳桿菌LC9-H、LC9-M組小鼠的糞便水分質量分數(shù)顯著高于空白組。

表4 灌胃第15天時小鼠糞便中SCFAs的含量Tab. 4 Contents of SCFAs in feces on Day 15 of intragastric administration

前期實驗結果表明，灌胃菌液前，各組小鼠腸道內各種SCFAs含量并無顯著差異。由表4可知，灌胃后各乳桿菌處理組小鼠的SCFAs含量均呈現(xiàn)上升趨勢，其中，干酪乳桿菌LC9-M組乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸的含量均顯著增加，發(fā)酵乳桿菌LF37-M干預組乙酸與正丁酸的含量顯著上升，鼠李糖乳桿菌LR45-M組丙酸的含量顯著上升。體外實驗表明受試乳桿菌具有一定的產SCFAs能力，從而解釋了其攝入后小鼠糞便內SCFAs含量的提高。但SCFAs增加量顯著高于其體外產酸能力，可能是受試乳桿菌在小鼠腸道內產生一定量的SCFAs，降低了腸道pH值，從而促進了產SCFAs菌株的生長，進一步提高了腸道中SCFAs的含量。

2.2.4 所選菌株對小鼠糞便菌群的影響

圖11 小鼠糞便菌群門水平相對豐度Fig. 11 Relative abundance of mouse fecal microbiota at phylum level

由圖11可知，小鼠糞便菌群中共檢測出7 個門，主要由Firmicutes（（26.7±4.5）%）和Bacteroidetes（（61.6±0.3）%）組成，除干酪乳桿菌LC9-H外的所有干預組小鼠糞便中Verrucomicrobia的相對豐度與空白組相比均明顯增加，其中干酪乳桿菌LC9-H、發(fā)酵乳桿菌LF37-H、鼠李糖乳桿菌LR45-L干預組小鼠糞便中Firmicutes的相對豐度明顯降低，干酪乳桿菌LC9-M、LC9-L干預組小鼠糞便中Proteobacteria的相對豐度明顯增加。

圖12 小鼠糞便中相對豐度大于0.1%的菌屬Fig. 12 Relative abundance of genera above 0.1% in mouse fecal microbiota

由圖12可知，小鼠糞便菌群中共檢測出254 個屬，其中相對豐度超過0.1%的屬有30 個。小鼠腸道菌群中相對豐度最高的2 個優(yōu)勢屬分別屬于S24-7與Rikenellaceae。與空白組相比，所有干預組小鼠糞便中Lactobacillus、Akkermansia的相對豐度均明顯增加，除發(fā)酵乳桿菌LF37-M、鼠李糖乳桿菌LR45-H、LR45-L外，其余干預組Allobaculum的相對豐度明顯增加，而Clostridiales的相對豐度明顯下降。此外，所有干預組Lachnospiracea未知菌屬的相對豐度明顯降低。

Akkermansia屬于Verrucomicrobia門，研究表明，Akkermansia能通過降解黏蛋白產生SCFAs，對宿主代謝異常如肥胖以及免疫疾病如腸道炎癥等有一定調節(jié)作用[35]，而Allobaculum、Clostridiales屬于Firmicute門，其中Allobaculum與飲食中脂肪含量的高低密切相關，能促進腸道丙酸的產生，改善腸道微環(huán)境[36]，Akkermansia、Allobaculum相對豐度的提高進一步解釋了小鼠腸道內SCFAs含量的增加。此外，有研究顯示，Clostridiales相對豐度的增加可能與一些腸道并發(fā)癥如結腸炎等的發(fā)生有關[37]。綜合門、屬水平的菌群差異可知，所選乳桿菌對腸道菌群結構有一定的調節(jié)作用。

3 結 論

諸多研究表明，腸道功能紊亂與功能性便秘等腸道疾病密切相關，而外源性益生菌的補充能有效地調節(jié)腸道功能[38]。本實驗通過乳桿菌生理特性體外實驗的篩選與動物實驗的功能評價，最終從45 株乳桿菌中篩選出3 株具有調節(jié)腸道功能的乳桿菌，分別為干酪乳桿菌LC9、發(fā)酵乳桿菌LF37和鼠李糖乳桿菌LR45，這3 種乳桿菌在耐受模擬胃腸道消化后仍能保持一定的活性，能發(fā)酵3 種低聚糖，兼?zhèn)淞己玫漠aSCFAs能力。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，這3 株菌均可以提高小鼠的小腸推進率，縮短首粒排黑便時間，促進腸道蠕動，并進一步增加了有益菌在腸道菌群中的相對豐度，改善糞便菌群結構。因此，這3 株菌可以作為潛在的益生菌，應用于腸道功能的調節(jié)。