楊東升，劉 臘，李 鵬

（海南大學(xué) 材料與化工學(xué)院，海南 海口 570228）

乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）是酶法合成酯類、脂質(zhì)、萜類等具有重要工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的化合物的重要合成前體，參與了微生物中100多條合成與分解代謝途徑[1]，它既是合成酵母細(xì)胞組成物質(zhì)的關(guān)鍵物質(zhì)，又是是酯類形成的主要限制因子[2]。乙酰輔酶A是生物合成脂肪酸的基礎(chǔ)，也是生物合成酯類的構(gòu)成物，酯的合成與脂肪酸的合成存在著對(duì)酰基輔酶A的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，因此，有利于脂肪酸的合成，會(huì)影響酯的合成[3-4]。酯類是影響啤酒風(fēng)味最大和最重要的化合物之一，盡管啤酒中的酯類含量不高，但其對(duì)啤酒風(fēng)味的影響非常大。合理控制啤酒中酯類含量，將賦予啤酒協(xié)調(diào)的風(fēng)味[5]。

當(dāng)環(huán)境條件有利于酵母的生長(zhǎng)繁殖時(shí)，例如麥汁中含有足量的可同化氮并在好氣條件下，酵母需要合成較多的脂肪酸來(lái)合成細(xì)胞膜進(jìn)行繁殖時(shí)，酯的合成就會(huì)減少。任何影響乙酰輔酶A的生物合成或消耗乙酰輔酶A的反應(yīng)都會(huì)影響酯的生物合成。相反，環(huán)境條件不利于酵母的生長(zhǎng)繁殖時(shí)，如在缺少可同化氮或培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分不均衡的情況下，酵母較快通過(guò)糖酵解形成大量乙酰輔酶A，并以此為底物合成大量酯[6]。特別是啤酒高濃發(fā)酵，造成成品啤酒強(qiáng)烈的溶劑味，形成風(fēng)味缺陷[7]。

CO2是啤酒發(fā)酵過(guò)程自生產(chǎn)物，在密封的啤酒發(fā)酵環(huán)境中，其濃度會(huì)越來(lái)越高直至發(fā)酵停止。CO2能影響酵母的代謝途徑，改變代謝產(chǎn)物的種類、生成速率和產(chǎn)量[8]。CO2可以直接抑制酵母的生長(zhǎng)和代謝，尤其是抑制對(duì)酵母代謝起關(guān)鍵作用的脫羧反應(yīng)，脫羧反應(yīng)的減少進(jìn)而影響酯類合成底物乙酰輔酶A的形成[9]。另外，一些酶蛋白上可能存在一個(gè)特定的陰離子敏感位點(diǎn)，其會(huì)受到HCO-3的抑制[10]，使代謝方向發(fā)生改變。如在一定壓力范圍內(nèi)，隨著外加CO2分壓的上升，使更多的丙酮酸作為反應(yīng)底物通過(guò)生成乙醛轉(zhuǎn)化成酒精[11-12]，從而減少乙酰輔酶A的形成，進(jìn)而影響酯的生成。研究發(fā)現(xiàn)[13]，低濃度CO2可以刺激酵母的生長(zhǎng)。合理的背壓可以控制丙酮酸到乙酰輔酶A的脫羧過(guò)程對(duì)CO2抑制的敏感度。比如，現(xiàn)代啤酒發(fā)酵通過(guò)密封罐調(diào)整背壓確保發(fā)酵過(guò)程的順利進(jìn)行，尤其是大規(guī)模的高濃度和超高濃度啤酒發(fā)酵技術(shù)使發(fā)酵環(huán)境壓力、CO2濃度更高，對(duì)酵母生長(zhǎng)代謝及酯類代謝的影響更是不能忽視[7]。綜上，保持合理的CO2背壓非常重要，除了可以控制酵母生長(zhǎng)速度，又可以控制乙酰輔酶A的消耗，導(dǎo)致影響酯的形成。然而，現(xiàn)有研究CO2對(duì)啤酒生產(chǎn)影響僅局限于單一的因素分析，未能充分揭示在CO2背壓下，乙酰輔酶A與酵母生長(zhǎng)、酯類形成的相關(guān)性。

本研究通過(guò)控制比較啤酒背壓發(fā)酵與常壓發(fā)酵，通過(guò)檢測(cè)主發(fā)酵過(guò)程中乙酰輔酶A、酵母生長(zhǎng)和酯類形成的變化，分析CO2對(duì)啤酒發(fā)酵基本參數(shù)的影響，揭示乙酰輔酶A與釀酒酵母生長(zhǎng)和酯類生成的規(guī)律，對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)適宜風(fēng)味的啤酒具有十分重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）NCYC 1108、麥汁（12°Bx）：海南大學(xué)生物工程綜合實(shí)驗(yàn)室；檸檬酸合酶（100 U/m L）：美國(guó)Sigma公司；疏基乙醇、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、甘油、Tris-HCl（pH=7.5）、蘋果酸脫氫酶（30.4 kU/m L）、L-蘋果酸、氧化型輔酶I（β-nicotinam ide adenine dinucleotide trihydrate，NAD）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

100L啤酒自釀系統(tǒng)：哈爾濱漢德啤酒有限公司；JY92IIN超聲波細(xì)胞破碎儀：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；5424高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；6890N氣相色譜（gaschromatography，GC）儀：美國(guó)Agilent公司；TU-1810紫外可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MLS3780高壓蒸汽滅菌鍋：三洋電機(jī)株式會(huì)社；ATY224島津電子天平：日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 啤酒常壓發(fā)酵和CO2背壓發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

CO2背壓發(fā)酵：關(guān)閉排空閥，高泡期形成后，使壓強(qiáng)自動(dòng)上升至0.05MPa，保持，如果壓力繼續(xù)升高，則通過(guò)排氣保持壓力，發(fā)酵溫度10℃。

常壓發(fā)酵：排空閥保持常開，發(fā)酵溫度10℃。

1.3.2 分析檢測(cè)

（1）酵母計(jì)數(shù)[14]

酵母計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板法。

（2）乙酰輔酶A含量測(cè)定[15]

乙酰輔酶A提取試劑：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）2.5 g、100mmol/L的巰基乙醇37μL、100mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）500μL和甘油5m L溶于50mmol/L，pH值為7.5，100m L的Tris-HCl緩沖溶液后組成，置于試劑瓶中，4℃保存[15]。

乙酰輔酶A檢測(cè)試劑：蘋果酸脫氫酶0.3mg，檸檬酸合酶10 μL，蘋果酸30mg和氧化型輔酶I（NAD）7.5mg溶于50mmol/L，pH值為7.5，23m L的Tris-HCl緩沖溶液中[15]。

樣品制備：取20 m L發(fā)酵液于50 m L無(wú)菌離心管中，5 000 r/min離心15min，收集離心沉淀，用生理鹽水洗滌酵母菌體兩次。棄上清，沉淀按照每400萬(wàn)細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞加入1m L的乙酰輔酶A提取試劑，并且采用功率為20W的超聲波，對(duì)離心管內(nèi)的細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次，破碎細(xì)胞，然后采用13 000×g離心條件，4℃離心10m in，取上清，置冰上，用于測(cè)定乙酰輔酶A[15]。

乙酰輔酶A含量測(cè)定[15]：分光光度計(jì)預(yù)熱30min，用蒸餾水于波長(zhǎng)340 nm處調(diào)零；取230μL的乙酰輔酶A檢測(cè)試劑和25μL樣本至微量石英比色皿，混勻；立即記錄波長(zhǎng)340 nm處20 s時(shí)的吸光度值A(chǔ)1和80 s時(shí)的吸光度值A(chǔ)2；計(jì)算吸光度值ΔA=A2-A1；以吸光度值ΔA（x）為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（y，nmol/mg）為縱坐標(biāo)，繪制乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用乙酰輔酶A標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1 640x+0.012計(jì)算樣品中乙酰輔酶A含量。

（3）總酯含量測(cè)定

采用頂空氣相色譜法測(cè)定乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯。氣相色譜條件如下：采用毛細(xì)管HP-NIONAX柱（30m×0.32mm×0.25μm），頂空采樣器HP7694E，注入溫度225℃；柱溫程序：在40℃條件下保持3min，然后在5℃/min增加到90℃；檢測(cè)器溫度300℃；載氣為氮?dú)猓∟2）；載氣流量30m L/m in；氫氣（H2）流量40m L/m in；空氣流量400m L/m in；分流比6∶1；樣品瓶平衡溫度50℃；平衡時(shí)間30m in；循環(huán)溫度60℃；傳輸線溫度65℃，進(jìn)樣量0.5μL。工作站軟件PG2070AA[16-17]。根據(jù)保留值進(jìn)行定性分析，利用外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。相關(guān)性分析采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件。其中P＜0.01表示兩因素極顯著相關(guān)；P＜0.05表示兩因素顯著相關(guān)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2背壓與常壓啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A、酵母細(xì)胞數(shù)量及總酯含量及減少率的變化

研究常壓和CO2背壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A、酵母細(xì)胞數(shù)量及總酯含量變化，結(jié)果見圖1。

圖1 常壓與CO2背壓啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A、酵母細(xì)胞數(shù)量及總酯含量變化Fig.1 Changes of acetylcoenzyme A,yeast cellnumber and total ester content in beer fermentation under atmospheric pressure and CO2 top pressure conditions

由圖1可知，乙酰輔酶A含量在發(fā)酵初期（0～20 h）急速增長(zhǎng)，并在20 h時(shí)達(dá)到峰值（常壓和CO2背壓條件下分別為17 nmol/mg和12 nmol/mg），乙酰輔酶A含量受壓力影響明顯；發(fā)酵時(shí)間為20～60 h時(shí)乙酰輔酶A含量急劇減少，常壓和CO2背壓分別減少至8.6 nmol/mg和7.7 nmol/mg；發(fā)酵時(shí)間為60～100 h，乙酰輔酶A含量緩慢降低，常壓和CO2背壓分別降低至7.8 nmol/mg和7.5 nmol/mg；發(fā)酵時(shí)間＞100 h之后，常壓和CO2背壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量均趨于穩(wěn)定一致。

由圖1可知，在常壓發(fā)酵條件下，酵母細(xì)胞數(shù)量在0～100 h逐漸增加，并在100 h時(shí)達(dá)到峰值，為3×107個(gè)/m L，發(fā)酵時(shí)間＞100 h之后，酵母細(xì)胞數(shù)量逐漸下降；在CO2背壓發(fā)酵條件下，酵母細(xì)胞數(shù)量在0～140 h逐漸增加，并在140 h時(shí)達(dá)到峰值，為3.5×107個(gè)/m L，發(fā)酵時(shí)間＞140 h之后，酵母細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。兩種發(fā)酵條件下酵母細(xì)胞數(shù)量在180 h之后趨于一致。

由圖1可知，在常壓發(fā)酵條件下，總酯的含量在0～100h逐漸增加，并在100 h時(shí)達(dá)到峰值，為35mg/L，發(fā)酵時(shí)間＞100 h之后，總酯的含量趨于穩(wěn)定；在CO2背壓發(fā)酵條件下，總酯含量在0～180 h逐漸增加，并在180 h時(shí)達(dá)到峰值，為28mg/L，發(fā)酵時(shí)間＞180 h之后，總酯含量趨于穩(wěn)定。常壓發(fā)酵條件下總酯含量始終高于CO2背壓發(fā)酵。

由圖1可得初步結(jié)論，CO2背壓令乙酰輔酶A減少，同時(shí)抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)及總酯的生成，使酵母細(xì)胞生長(zhǎng)及總酯含量生成峰值滯后。CO2背壓啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A、酵母細(xì)胞數(shù)量及總酯含量減少率結(jié)果見圖2。

圖2 CO2背壓引起啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A、酵母細(xì)胞數(shù)量及總酯含量減少率Fig.2 Reduction rate of acetyl coenzyme A,cellnum ber and totalester content in beer fermentation under CO2 top pressure conditions

由圖2可知，乙酰輔酶A主要活躍在啤酒發(fā)酵0～120h，其中在0～20 h乙酰輔酶減少率上升，并在20 h時(shí)乙酰輔酶減少率達(dá)到最大，在20～120 h減少率下降，120 h之后減少率穩(wěn)定。120 h之后對(duì)乙酰輔酶A含量影響不大；酵母酵母細(xì)胞減少率在0～60 h范圍逐漸增大，并在60 h時(shí)達(dá)到最大，酵母酵母細(xì)胞減少率在60～180 h范圍急劇減少，酵母酵母細(xì)胞減少率在發(fā)酵時(shí)間＞180h之后變化不大；總酯含量減少率在0～20 h范圍逐漸增大，并在20 h時(shí)達(dá)到最大，總酯含量減少率在20～180 h范圍逐漸減少，在發(fā)酵時(shí)間＞180 h之后變化不大。CO2背壓對(duì)酯生成的影響從其他研究中可以得到相似的結(jié)果，10 d的啤酒壓力發(fā)酵抑制了酵母的繁殖和一些風(fēng)味物質(zhì)的生成。CO2背壓對(duì)乙酰輔酶A的主要影響時(shí)段為0～120h，120h后未見影響；對(duì)酵母數(shù)量和總酯含量影響的主要時(shí)段為0～180 h，180 h后未見影響。

2.2 常壓與CO2背壓啤酒發(fā)酵乙酰輔酶A與酵母數(shù)量的相關(guān)性

常壓與CO2背壓啤酒發(fā)酵乙酰輔酶A與酵母數(shù)量的相關(guān)性見圖3。

圖3 常壓（A）和CO2背壓（B）啤酒發(fā)酵乙酰輔酶A與酵母數(shù)量的相關(guān)性Fig.3 Correlation between acetyl coenzyme A and yeast cellnumber in beer ferm entation under atm ospheric pressure(A)and CO2 top pressure(B)conditions

由圖3A可知，常壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量與酵母數(shù)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)R=0.93717。由圖3B可知，背壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量與酵母數(shù)量同樣呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)R=0.905 66。

在酵母生長(zhǎng)過(guò)程中，有很大一部分的碳代謝流通過(guò)乙酰輔酶A合成酶途徑形成乙酰輔酶A，并參與到其他的細(xì)胞器的重要化合物的合成反應(yīng)中去。因此，乙酰輔酶A的減少將直接影響到酵母數(shù)量的減少[5]。

施加CO2背壓啤酒發(fā)酵后，乙酰輔酶A減少率與酵母數(shù)量減少率的相關(guān)性見圖4。由圖4可知，乙酰輔酶A減少率與酵母數(shù)量減少率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)R=0.803 48。說(shuō)明在CO2背壓影響下，酵母數(shù)量減少極有可能是乙酰輔酶A減少引起的。釀酒酵母中最豐富的酰基輔酶A是乙酰輔酶A，它可以通過(guò)丙酮酸的氧化脫羧或用三磷酸腺苷直接激活乙酸而形成[4]。這是發(fā)生在酵母細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)，在壓力的作用下，丙酮酸的氧化脫羧作用受阻[9]，減少乙酰輔酶A的生成，同時(shí)乙酸受壓力影響滲出胞外增加，使得可用于激活的乙酸隨之減少[19-20]。酵母生長(zhǎng)可利用的乙酰輔酶A減少，細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)減少。

圖4 乙酰輔酶A減少率與酵母數(shù)量減少率的相關(guān)性Fig.4 Correlation between acetyl coenzyme A reduction rate and yeast cellnumber reduction rate

2.3 常壓與CO2背壓啤酒發(fā)酵乙酰輔酶A與總酯含量的相關(guān)性

常壓與CO2背壓啤酒發(fā)酵乙酰輔酶A與總酯含量的相關(guān)性見圖5。由圖5可知，常壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量與總酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r=-0.83396。CO2背壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量與總酯含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.750 42。乙酰輔酶A是生物合成脂肪酸的基礎(chǔ)，也是生物合成酯類的構(gòu)成物，酯的合成與脂肪酸的合成存在著對(duì)酰基CoA的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，因此，有利于脂肪酸的合成，會(huì)影響酯的合成[3]。換言之，乙酰輔酶A含量的增加有利于酵母生長(zhǎng)，會(huì)影響酯的合成。

圖5 常壓（A）和CO2背壓（B）啤酒發(fā)酵乙酰輔酶A與總酯含量的相關(guān)性Fig.5 Correlation between acetyl coenzyme A and totalester content in beer fermentation under atmospheric pressure(A)and CO2 top pressure(B)conditions

乙酰輔酶A的量的分配決定了生化途徑的走向和強(qiáng)度，乙酰輔酶A也因此成為一個(gè)衡量碳流向的蓄水池，其“水位”的高位決定了酯合成的強(qiáng)度、脂質(zhì)和氨基酸合成量的大小[4]。結(jié)合圖1，乙酰輔酶A是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的先決條件，不管施壓與否，乙酰輔酶A的生成總是先于酯的合成。乙酰輔酶A的消耗用于酯的合成，因此兩者呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

施加CO2背壓后，乙酰輔酶A減少率與總酯含量減少率的相關(guān)性見圖6。由圖6可知，在CO2背壓影響下，乙酰輔酶A減少率與總酯含量減少率呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)r=0.800 29。乙酰輔酶A除了參與細(xì)胞內(nèi)的許多其他反應(yīng)，包括脂質(zhì)和氨基酸的生物合成，以及三羧酸循環(huán)以外，還參與酯的合成[4]。在乙酰輔酶A的總量控制方面，如果在發(fā)酵系統(tǒng)中添加脂質(zhì)（如長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸）就可以減少酵母細(xì)胞合成對(duì)乙酰輔酶A的需求，增加酯的合成，然而施加CO2背壓結(jié)果完全相反，乙酰輔酶A的總量因此減少，不單細(xì)胞合成受到抑制，酯的合成也受到影響。乙酰輔酶A減少率與總酯含量減少率遵循的這種相關(guān)關(guān)系，反映了在CO2背壓下，乙酰輔酶A對(duì)總酯生成的重要性。

圖6 乙酰輔酶A減少率與總酯含量減少率的相關(guān)性Fig.6 Correlation between acetyl coenzyme A reduction rate and totalester content reduction rate

在正常情況下，酵母需要合成較多的脂肪酸來(lái)合成細(xì)胞膜進(jìn)行繁殖時(shí)，酯的合成就會(huì)減少。任何影響乙酰輔酶A的生物合成或消耗乙酰輔酶A的反應(yīng)都會(huì)影響酯的生物合成。環(huán)境條件不利于酵母的生長(zhǎng)繁殖時(shí)，如在CO2背壓的情況下，乙酰輔酶A生成受阻，優(yōu)先供酵母生長(zhǎng)所需，并不會(huì)合成大量酯。

3 結(jié)論

乙酰輔酶A主要活躍在啤酒發(fā)酵0～120 h，乙酰輔酶A含量在發(fā)酵初期（0～20h）急速增長(zhǎng)，并在20h時(shí)達(dá)到峰值，常壓和CO2背壓條件下分別為17 nmol/mg和12 nmol/mg，發(fā)酵時(shí)間＞100 h之后，常壓和CO2背壓發(fā)酵條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量均趨于穩(wěn)定一致。常壓和CO2背壓條件下酵母細(xì)胞數(shù)量分別在100 h、140 h時(shí)達(dá)到峰值，兩種發(fā)酵條件下酵母細(xì)胞數(shù)量在180 h之后趨于一致。在常壓和CO2背壓發(fā)酵條件下，總酯的含量分別在100 h、180 h時(shí)達(dá)到峰值，發(fā)酵時(shí)間＞180 h之后，總酯含量趨于穩(wěn)定。常壓發(fā)酵條件下總酯含量始終高于CO2背壓發(fā)酵。常壓與CO2背壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量與酵母數(shù)量均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。常壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量與總酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），CO2背壓條件下啤酒發(fā)酵中乙酰輔酶A含量與總酯含量呈負(fù)相關(guān)。