林超 董郭楓 張思琴 田學(xué)斌 周翠 張秀彩 張藝之 曹建明 周鐵麗

肺炎克雷伯菌作為腸桿菌科的成員之一，是引起社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染不可忽視的潛在病原體，目前已成為僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌，可使免疫功能受損的患者發(fā)生肺炎、尿路感染、菌血癥和腦膜炎等多種感染[1]。在過(guò)去的20年中，在健康和免疫力低下的人群中出現(xiàn)了一種與普通肺炎克雷伯菌不同的肺炎克雷伯菌，即伴有高黏表型的新高毒力肺炎克雷伯菌[2]，可使健康的年輕個(gè)體發(fā)生肝膿腫等侵襲性感染，并可從原發(fā)感染部位播散侵襲到其他器官，一旦發(fā)生侵襲性播散，患者常伴有嚴(yán)重且不可逆的難治性后遺癥[2-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由肺炎克雷伯菌所致的細(xì)菌性肝膿腫占肝膿腫的43%～66%[4]，患者常表現(xiàn)為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、肝腫大及肝區(qū)疼痛等全身膿毒性反應(yīng)，還可出現(xiàn)肝外侵襲綜合征，甚至并發(fā)血流感染。肝膿腫患者的中毒癥狀嚴(yán)重，若膿腫引流不徹底，抗菌藥物使用不及時(shí)，患者通常難以治愈[3]，嚴(yán)重威脅患者的健康甚至生命，因此臨床工作者應(yīng)高度重視。目前，肺炎克雷伯菌發(fā)揮致病性的主要毒力因子為莢膜、脂多糖和鐵載體[5]。其中，K1和K2血清型是高毒力肺炎克雷伯菌最常見的莢膜血清型，類黏蛋白表型調(diào)節(jié)基因A（rmpA）是激活莢膜生成，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生高黏表型且毒力增強(qiáng)的重要調(diào)節(jié)因子[6]，氣桿菌素鐵載體是肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)的重要因素[7]。本研究回顧性分析163例肺炎克雷伯菌肝膿腫患者的臨床特征，并探討肺炎克雷伯菌的的微生物學(xué)特征，旨在為臨床肝膿腫的診治提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 回顧2016年1月至2017年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的163例肺炎克雷伯菌肝膿腫患者的臨床資料。細(xì)菌性肝膿腫診斷標(biāo)準(zhǔn)：具有臨床特征（發(fā)熱、寒戰(zhàn)、腹痛、腹脹等），影像學(xué)（B超或CT）檢查結(jié)果符合肝膿腫影像學(xué)特征，微生物培養(yǎng)（膿液或血液）結(jié)果證實(shí)病原菌為肺炎克雷伯菌。根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[8]判斷感染類型：無(wú)明確潛伏期的感染，入院48h后發(fā)生的感染為醫(yī)院感染，48h以內(nèi)發(fā)生的感染為社區(qū)感染。肝膿腫治療療效判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：臨床癥狀、體征消失，膿腫縮小≥50%為顯著有效；臨床癥狀、體征改善，膿腫縮?。?0%為有效；臨床癥狀、體征無(wú)改善，膿腫無(wú)縮小為治療無(wú)效。

1.2 菌株鑒定 對(duì)分離出的163株肺炎克雷伯菌臨床菌株（已剔除同一患者相同部位重復(fù)分離的菌株）分別接種到哥倫比亞血瓊脂平板，在37℃培養(yǎng)箱中孵育18～24h；挑取單個(gè)純菌落，在無(wú)菌機(jī)用生理鹽水中調(diào)成0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬s 1.5×108CFU/ml）濁度的細(xì)菌懸液，采用VITEK 2型全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)其進(jìn)行鑒定確認(rèn)。

1.3 拉絲試驗(yàn) 將分離出的163株肺炎克雷伯菌臨床菌株接種至哥倫比亞血瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)箱中孵育18～24h，用接種環(huán)在單個(gè)菌落表面輕輕接觸并向側(cè)面牽拉，如黏液絲形成且長(zhǎng)度＞0.5cm，判斷為陽(yáng)性[10]。

1.4 藥敏試驗(yàn) 將分離出的163株肺炎克雷伯菌臨床菌株分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板，在37℃培養(yǎng)箱孵育18～24h；挑取單個(gè)純菌落，在無(wú)菌機(jī)用生理鹽水中調(diào)至 0.5 麥?zhǔn)蠁挝粷岫龋s 1.5×108CFU/ml）的菌懸液，加菌懸液至藥敏檢測(cè)卡，隨后于VITEK 2型微生物分析儀上機(jī)分析，從而獲得肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果，藥敏試驗(yàn)結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI 2017標(biāo)準(zhǔn)[11]進(jìn)行判讀。

1.5 毒力基因和莢膜血清型檢測(cè) 采用PCR擴(kuò)增法檢測(cè)細(xì)菌毒力基因和莢膜血清型。將已培養(yǎng)好的肺炎克雷伯菌置于裝有400μl去離子水的離心管中，100℃加熱15min，然后冰浴 10min，再 12 000g離心 5min，最后提取肺炎克雷伯菌DNA模板。PCR擴(kuò)增毒力基因rmpA和氣桿菌素，血清型 K1、K2、K5、K20、K54、K57。引物參照文獻(xiàn)[12-13] 合成，見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，GelRed染色后凝膠成像觀察結(jié)果，陽(yáng)性產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序，序列經(jīng)Blast和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)。

表1 毒力基因和莢膜血清型引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 163例肝膿腫患者的一般資料和臨床特征 肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫主要見于50歲以上的中老年患者，88.9%的患者具有發(fā)熱癥狀，49.7%的患者伴有糖尿病，見表2。

表2 163例肝膿腫患者的一般資料及臨床表現(xiàn)[例（%）]

2.2 拉絲試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，163株肺炎克雷伯菌中50株菌株為陽(yáng)性，提示具有高黏表型。

2.3 兩種類型肺炎克雷伯菌的耐藥情況 對(duì)臨床常用的抗菌藥物（哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、頭孢替坦、亞胺培南、厄他培南、頭孢曲松、頭孢吡肟、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明），50株高黏表型肺炎克雷伯菌菌株中的耐藥率均＜7%，113株非高黏表型肺炎克雷伯菌菌株的耐藥率均＜13%，見表3。

表3 兩種類型肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況[株（%）]

2.4 兩種類型肺炎克雷伯菌毒力基因和血清型分布情況 具有高黏表型的50株肺炎克雷伯菌均攜帶rmpA基因，攜帶率為100%，44株攜帶氣桿菌素，占88.0%（44/50）；K1、K2、K5、K20 血清型分別為 18 株、19 株、3株和1株，其中9株未分型，未檢到K54、K57血清型（圖1）。非高黏表型菌株毒力基因rmpA和氣桿菌素的檢出率分別為92.9%和84.1%。高黏表型肺炎克雷伯菌K2型顯著多于非高黏表型菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組菌株毒力基因攜帶率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 4。

圖1 毒力基因及莢膜血清型分型電泳結(jié)果（M：Marker；N：陰性對(duì)照）

2.5 不同毒力基因、莢膜血清型、治療方法患者的預(yù)后情況 163例肺炎克雷伯菌致肝膿腫患者中經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)116例，治療無(wú)效47例。兩組患者間毒力基因和莢膜血清型攜帶差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但采取引流的患者治療好轉(zhuǎn)率顯著高于未引流患者（P＜0.05）。見表5。

表4 兩種類型肺炎克雷伯菌毒力基因和莢膜血清型分布情況[株（%）]

3 討論

肝膿腫為臨床常見的疾病，其主要的臨床癥狀為發(fā)熱、寒戰(zhàn)、腹痛、惡心及嘔吐等全身膿毒性反應(yīng)，均為非特異性癥狀。有研究表明，肺炎克雷伯菌為肝膿腫的主要致病菌[3]，且肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫常見于60～70歲患者[14]。本研究結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌引起的肝膿腫主要見于50歲以上患者，其中46%的患者年齡≥65 歲；88.9%的患者伴有發(fā)熱，81.0%的患者伴有畏寒、寒戰(zhàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。這些癥狀出現(xiàn)的時(shí)間較早，但由于其為非特異性癥狀，不能及時(shí)診斷為肝膿腫，導(dǎo)致無(wú)法盡早治療，從而影響患者康復(fù)。同時(shí)，本研究中49.7%的患者具有糖尿病基礎(chǔ)疾病，分析原因可能是糖尿病患者的免疫功能相對(duì)較差，使病原菌更易入侵機(jī)體，對(duì)病原菌的抵抗力也相對(duì)較弱。

有研究表明，肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)肝膿腫肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率較低，但長(zhǎng)期以來(lái)，碳青霉烯類藥物作為治療肺炎克雷伯菌感染有效的抗菌藥物之一，近年來(lái)耐藥菌株開始出現(xiàn)，導(dǎo)致碳青霉烯類藥物的治療效果有所減弱，在本研究中分離自肝膿腫肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥率為3%，提示我們需關(guān)注高毒力且耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的傳播，以免給臨床治療帶來(lái)更大的困難。

有研究顯示高毒力菌株內(nèi)rmpA基因的攜帶率接近100%[16]，證明rmpA與高毒力肺炎克雷伯菌具有顯著的相關(guān)性。同時(shí)，氣桿菌素是肺炎克雷伯菌鐵載體中最重要的鐵載體系統(tǒng)[17]，是肺炎克雷伯菌毒力增加的重要因素。因此攜帶rmpA和氣桿菌素的肺炎克雷伯菌通常具有高毒力。目前，肺炎克雷伯菌中K1和K2是高毒力肺炎克雷伯菌最常見的莢膜血清型[13]。本研究中高黏表型菌株與非高黏表型菌株毒力基因rmpA和氣桿菌素?cái)y帶率無(wú)明顯差異，rmpA攜帶率均＞90%，氣桿菌素?cái)y帶率均＞80%；高黏表型菌株K1莢膜血清型分布顯著少于非高黏表型菌株（P＜0.05），高黏表型菌株血清型均以K1和K2型常見，非高黏表型菌株血清型以K1型常見。基于以上結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)不論是否具有高黏表型，這些肝膿腫肺炎克雷伯菌幾乎都具有高毒力，因此，筆者推測(cè)判斷高毒力菌株不能僅以高黏表型為判斷標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)已有研究表明高黏表型與高毒力并不是完全相關(guān)，攜帶rmpA和氣桿菌素的菌株即使不具有高黏表型也具有高毒力[18]。因此，在臨床治療過(guò)程中不能因?yàn)榛颊吒腥镜姆窝卓死撞鸀榉歉唣け硇途甓J(rèn)為其毒力較低而輕視這些患者的治療，需結(jié)合臨床癥狀及時(shí)對(duì)患者進(jìn)行有效治療。

本研究中163例患者均進(jìn)行了抗菌藥物治療，其中進(jìn)行引流治療135例，未進(jìn)行引流治療28例，經(jīng)引流治療的患者好轉(zhuǎn)率明顯高于未進(jìn)行引流治療的患者（P＜0.05），因此，可認(rèn)為引流治療是肝膿腫治療的重要有效手段。筆者推測(cè)患者預(yù)后與患者基礎(chǔ)疾病、自身免疫力、所使用的抗菌藥物、是否引流等多種因素有關(guān)，其中引流是否及時(shí)是一個(gè)重要影響因素。

表5 不同毒力基因、莢膜血清型、治療方法患者的預(yù)后情況[株（%）]

綜上所述，肺炎克雷伯菌肝膿腫常見于中老年患者，對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率低，但已出現(xiàn)多重耐藥菌株，需引起高度關(guān)注，防止多重耐藥的高毒力肺炎克雷伯菌的擴(kuò)散；同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)菌株即使不具有高黏表型，但也可能具有高毒力；一旦發(fā)現(xiàn)肝膿腫患者，應(yīng)密切關(guān)注其臨床表現(xiàn)，制定合理的治療方案，及時(shí)使用抗菌藥物和進(jìn)行引流治療，從而提高患者的好轉(zhuǎn)率/治愈率。