楊海寧 寧豫昌,2 王昌毓 翁佩芳 吳祖芳,* 朱亞珠

(1 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832；2 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3 浙江國(guó)際海運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 浙江 舟山 316021)

魚(yú)露又稱魚(yú)醬油，是一種以海洋魚(yú)類蛋白質(zhì)水解制得的汁液，色澤呈琥珀色，味道鮮美且?guī)в邢涛逗王r味。魚(yú)露富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，除含有人體所需的8種必需氨基酸外，還含有多種有機(jī)酸和微量元素[1]，在一些地區(qū)魚(yú)露甚至還作為一種必需膳食蛋白和氨基酸的來(lái)源[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，魚(yú)露的生產(chǎn)以自然發(fā)酵法為主，但該方法存在發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)(通常1～2年)等缺陷，制約了魚(yú)露產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，利用外加微生物促進(jìn)魚(yú)蛋白降解已成為縮短魚(yú)露發(fā)酵周期的重要研究方向。Yongsawatdigul等[3]向印度鳀魚(yú)中接種分離于自然發(fā)酵魚(yú)露中的蛋白酶產(chǎn)生菌枝芽孢桿菌(Virgibacillussp)SK37，發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵4個(gè)月的魚(yú)露總氨基酸含量與傳統(tǒng)發(fā)酵12個(gè)月的樣品相當(dāng)。Akolkar等[4]報(bào)道采用蛋白酶產(chǎn)生菌-嗜鹽菌(Halobacteriumsp.)SP1(1)作為起始培養(yǎng)物可以加速魚(yú)露發(fā)酵，且所獲魚(yú)露在必需氨基酸和風(fēng)味氨基酸含量方面優(yōu)于商品魚(yú)露。Udomsil等[5]報(bào)道向印度鳀魚(yú)中按順序添加分離自發(fā)酵魚(yú)露中的嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)MS33和蛋白酶產(chǎn)生菌枝芽孢桿菌(Virgibacillussp.)SK37，不僅可以提高魚(yú)露中揮發(fā)性化合物和谷氨酸的含量，還能提高魚(yú)露的整體可接受性。

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)是2010年發(fā)現(xiàn)的新菌種[6]。通過(guò)比較基因組學(xué)結(jié)合形態(tài)、生理、化學(xué)分類和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，已證實(shí)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌KACC 13015T與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis) NRRL B-41580T具有表型一致性和基因型一致性[7]，即甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌同歸屬于貝萊斯芽孢桿菌。曹紅等[8]在研究貝萊斯芽孢桿菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌種能產(chǎn)生高活力胞外蛋白酶；此外，研究表明，該菌種在適宜條件下可產(chǎn)生淀粉酶[9]、纖維素酶[10]、幾丁質(zhì)酶[11]和脂肪酶[12]等。由于該菌種具有良好的生物安全性[13]和益生功能[14]，且該菌株具有一定的耐鹽性，因此其具有應(yīng)用于食品發(fā)酵的潛力。但目前尚未見(jiàn)到將該菌種應(yīng)用于魚(yú)露發(fā)酵的相關(guān)報(bào)道，故本研究以低值鳀魚(yú)為原料，接種SW5菌株，在發(fā)酵期間測(cè)定魚(yú)露營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)氨基酸態(tài)氮和水產(chǎn)品新鮮度主要指標(biāo)揮發(fā)性鹽基氮等，在發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵醪液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以判斷接種貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株對(duì)發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

貝萊斯芽孢桿菌SW5，由寧波大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏；冷凍鳀魚(yú)，購(gòu)自浙江舟山興業(yè)有限公司；舟山商品魚(yú)露，購(gòu)自浙江舟山興業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

7890B7000C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，美國(guó)安捷倫公司；SPME 75 μm萃取頭，美國(guó)Supelco公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；TE214S分析天平，成都浩馳儀器有限公司；XPX智能生化培養(yǎng)箱，江南儀器廠；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-40B Ⅰ型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；5804R高速大容量冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；MGH-90電動(dòng)攪肉機(jī)，佛山名健電器制造有限公司；QYC-2102C全溫振蕩培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備 將SW5菌株從試管斜面接種至40 mL/100 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃、120 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，備用。

1.3.2 SW5菌株生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線測(cè)定 將培養(yǎng)12 h的貝萊斯芽孢桿菌SW5以5%的接種量加入100 mL/250 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取一次樣品，采用比濁法[15]測(cè)定SW5菌株的生長(zhǎng)曲線。以國(guó)標(biāo)GB/T 23527-2009[16]中福林酚法測(cè)定SW5菌株蛋白酶活力，每個(gè)樣品測(cè)定3次，并繪制SW5菌株產(chǎn)酶曲線。

1.3.3 原料前處理 將冷凍鳀魚(yú)流水解凍，瀝干水分后去除頭和內(nèi)臟。將鳀魚(yú)與蒸餾水按照固液比1∶0.6(m/v)混合并使用絞肉機(jī)打成魚(yú)糜[17]，然后裝入500 mL錐形瓶中，每瓶200 g，放入75℃水浴鍋中，待魚(yú)糜樣品中心溫度達(dá)到75℃后保溫21 min[18]，以達(dá)到巴氏消毒的目的，冷卻至室溫，備用。

1.3.4 魚(yú)露樣品制備 試驗(yàn)分組：處理組1：取5%魚(yú)糜總量的貝萊斯芽孢桿菌種子液，8 000 r·min-1離心(4℃)15 min得到菌體細(xì)胞，然后將菌體細(xì)胞接種至巴氏消毒后的魚(yú)糜中，37℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d，添加20%食鹽，繼續(xù)發(fā)酵4 d；處理組2：巴氏消毒后的魚(yú)糜除了不接種試驗(yàn)菌，其余操作均與處理組1相同；處理組3：將解凍鳀魚(yú)(不去除頭和內(nèi)臟)與蒸餾水按照固液比1∶0.6混合并使用絞肉機(jī)打成魚(yú)糜，直接加入20%食鹽混勻，模擬自然發(fā)酵。每個(gè)處理組均作3次重復(fù)。

分析樣品制備：取20 mL發(fā)酵醪液，4℃、8 000 r·min-1離心10 min，取中層清液，重復(fù)離心(4℃，8 000 r·min-1，10 min)1次，合并2次離心得到的中層清液，雙層濾紙過(guò)濾后制備成待測(cè)樣品。

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定 氨基酸態(tài)氮(amino acid nitrogen, AA-N)含量測(cè)定采用甲醛滴定法[19]；揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)含量測(cè)定采用半微量定氮法[19]；pH值測(cè)定采用數(shù)字式pH計(jì)；總酸含量測(cè)定采用甲醛滴定法。

1.3.6 GC-MS分析揮發(fā)性風(fēng)味成分 吸取3 mL待測(cè)樣品放入標(biāo)準(zhǔn)頂空進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，其氣相部分(頂空)導(dǎo)入頂空進(jìn)樣裝置連接的氣相色譜。萃取頭老化：按照SUPELCO公司推薦的條件，第一次使用時(shí)將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口210℃老化1 h，之后每次使用前老化0.5 h，至無(wú)干擾峰出現(xiàn)。

頂空固相微萃?。簻?zhǔn)確取3 mL待測(cè)樣品，置于頂空瓶中，于60℃平衡15 min。將活化好的固相微萃取器插入平衡后的樣品，頂空恒溫振蕩萃取30 min，振蕩速率為250 r·min-1。取出插入氣相色譜柱的進(jìn)樣口解吸附7 min，解析溫度為210℃。

色譜條件：毛細(xì)管柱為Vocal(60 m×0.32 mm×1.8 μm)。載氣為高純氦氣，恒定流速3 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度210℃，不分流進(jìn)樣模式。柱溫箱采用程序升溫：起始溫度35℃，保持3 min，以3℃·min-1升至40℃，保持1 min，再以5℃·min-1升至200℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：采用全掃描模式采集信號(hào)，電離方式EI，電子轟擊能量為70 eV；接口溫度220℃，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，掃描質(zhì)量范圍m/z 40～600，掃描頻率3.6 scans·s-1。

定性定量分析：化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與NIST 14 Library相匹配，選擇較高匹配度的檢索結(jié)果與質(zhì)譜圖庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、復(fù)合，進(jìn)行人工譜圖解析確認(rèn)揮發(fā)性成分，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的已知化合物確認(rèn)檢測(cè)物成分。按照面積歸一化法進(jìn)行定量分析，求得各化學(xué)成分的相對(duì)百分含量[20]。將舟山商品魚(yú)露與上述待測(cè)樣品一同測(cè)量，并進(jìn)行比較分析。

1.3.7 感官評(píng)價(jià)分析 采用描述性定量分析(quantitative descriptive analysis test)法對(duì)樣品進(jìn)行感官分析，評(píng)定小組由10位食品專業(yè)的老師與研究生組成(5男5女，年齡在20～35歲之間)。感官評(píng)定前，對(duì)評(píng)定人員進(jìn)行一致的魚(yú)露感官特性描述培訓(xùn)，培訓(xùn)后對(duì)魚(yú)露的感官特性鮮味(umami)、腐臭味(rancid)、魚(yú)腥味(fishy)、酸味(sour)、肉味(meaty)、咸味(salty)、干酪味(cheesy)、水果香味(fruity)進(jìn)行打分，計(jì)分采用5分制，0分表示該風(fēng)味不能被感受到，5分代表該風(fēng)味非常強(qiáng)烈。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，所有數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件分析，應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)和鄧肯法(Duncan’s)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析。采用OriginPro 9.1制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SW5菌株生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

由圖1可知，SW5菌株在該培養(yǎng)條件下無(wú)延滯期，對(duì)數(shù)期是0～16 h，穩(wěn)定期是16～26 h，衰亡期是26～48 h，在后續(xù)試驗(yàn)中種子菌齡統(tǒng)一選擇培養(yǎng)時(shí)間為12 h的。由SW5菌株產(chǎn)酶曲線可知，該菌株從2 h開(kāi)始產(chǎn)生蛋白酶，26 h和32 h有2個(gè)產(chǎn)酶高峰，至48 h發(fā)酵液中仍有高活力蛋白酶，說(shuō)明該菌株可以用于發(fā)酵制備魚(yú)露。

圖1 SW5菌株生長(zhǎng)曲線和蛋白酶活力曲線Fig.1 Growth curve and protease activity curve of strain SW5

2.2 發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)結(jié)果分析

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量 氨基酸態(tài)氮(AA-N)是以氨基酸形式存在的氮元素含量，該指標(biāo)越高，說(shuō)明魚(yú)露中氨基酸含量越高，是衡量魚(yú)露品質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組2 AA-N含量幾乎不變，處理組3 AA-N含量緩慢增加。前期預(yù)試驗(yàn)表明處理組1 AA-N含量至第6天時(shí)達(dá)到最大值，為0.76 g·100 mL-1，達(dá)到市售二級(jí)魚(yú)露水平[21]，隨后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中處理組1中AA-N始終高于處理組2和處理組3，可能是SW5菌種產(chǎn)生的大量蛋白酶可將處理組1中魚(yú)蛋白酶解，從而導(dǎo)致AA-N含量快速上升。綜上，在接種該菌株6 d時(shí)，發(fā)酵醪液中AA-N含量最高。后續(xù)試驗(yàn)以此為依據(jù)，選擇6 d作為發(fā)酵周期。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen content during fermentation

圖3 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化Fig.3 Changes of total volatile basic nitrogen content during fermentation

2.2.2 發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性鹽基氮含量 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)指蛋白質(zhì)、氨基酸等在微生物作用下分解形成氨、三甲胺等堿性含氮化合物，是衡量魚(yú)露腐敗變質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組2 TVB-N含量略有增加，但變化不明顯；處理組3 TVB-N含量呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)，至發(fā)酵第6天時(shí)，發(fā)酵醪液TVB-N含量為57.63 mg·100 mL-1，高于處理組2；而處理組1 TVB-N含量在發(fā)酵第1天緩慢增加，1～4 d快速增加，4 d后增加趨勢(shì)變緩，至發(fā)酵第6 天時(shí)，發(fā)酵醪液TVB-N含量為104.53 mg·100 mL-1，高于處理組2和處理組3。處理組1TVB-N含量持續(xù)增加可能與接種SW5菌株有關(guān)，SW5菌株在產(chǎn)生蛋白酶外可能還產(chǎn)生其他酶，將發(fā)酵醪液中氨基酸繼續(xù)分解為一些含氮化合物，導(dǎo)致TVB-N含量升高。

2.2.3 發(fā)酵過(guò)程中pH值和總酸的變化 魚(yú)露pH值和總酸是由游離氨基酸、有機(jī)酸類物質(zhì)和含氮化合物分解產(chǎn)生的微堿性物質(zhì)共同作用的結(jié)果。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組1 pH值先升高后下降，至發(fā)酵第6天時(shí)，發(fā)酵醪液pH值為5.86；處理組2與處理組3 pH值呈緩慢下降趨勢(shì)，至發(fā)酵第6天時(shí)，發(fā)酵醪液pH值分別達(dá)到5.39和5.41。由圖5可知，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，處理組1和處理組2總酸含量幾乎不變，可能是由于SW5菌株產(chǎn)酸能力較弱；而處理組3發(fā)酵醪液總酸含量呈上升趨勢(shì)，至發(fā)酵第6天時(shí)，其總酸含量達(dá)到0.91 g·100 mL-1。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化Fig.4 Changes of pH value during fermentation

圖5 發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Fig.5 Changes of total acid content during fermentation

2.3 魚(yú)露樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

由表1可知，處理組1、處理組2、處理組3和舟山商品魚(yú)露分別檢測(cè)出40、35、32和35種揮發(fā)性化合物，其中，處理組1中檢出的揮發(fā)性化合物種類最多，與處理組2相比，處理組1魚(yú)露樣品中醇類、醛類、酯類、呋喃類、含氮含硫化合物相對(duì)含量增加，且醛類化合物不僅數(shù)量增多，種類也由4種增加至13種，酸類、酮類、烷烴類及其他類的相對(duì)含量減少。

表1 魚(yú)露中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成 Table 1 The compositions of volatile compounds in fish sauce

表1(續(xù))

表1(續(xù))

注：“-”表示未檢出；相對(duì)百分含量=相對(duì)峰面積/總峰面積。同行不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：‘-’ means not detected. Relative percentage=relative peak area/total peak area. Different lowercase letters in the peer indicate significant difference at 0.05 level.

醇類化合物大多是由脂肪的氧化分解以及氨基酸和碳水化合物的氧化形成的[22]，具有芳香味、植物香、酸敗味等。處理組1醇類物質(zhì)相對(duì)百分含量較處理組2、處理組3高，1-戊烯-3-醇是處理組1相對(duì)百分含量最高的醇類，達(dá)7.78%，該物質(zhì)能產(chǎn)生烤洋蔥香味[23]。低分子量的揮發(fā)性酸構(gòu)成了魚(yú)露的干酪風(fēng)味[24]。3-甲基丁酸是4種魚(yú)露樣品共同檢測(cè)出的酸類化合物，其中，處理組1酸類化合物的種類和數(shù)量低于處理組2，正丁酸是舟山商品魚(yú)露相對(duì)百分含量最高的揮發(fā)性風(fēng)味化合物。醛類化合物的閾值比其他化合物閾值低，具有脂肪香味、水果香味和魚(yú)腥味[25]。苯甲醛是4種魚(yú)露樣品共同檢測(cè)出的化合物，能貢獻(xiàn)杏仁味[26]。處理組2檢測(cè)出的(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮的相對(duì)百分含量高達(dá)30.55%，該化合物具有特殊的奶油風(fēng)味[27]，處理組1中(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮含量低于處理組2。呋喃類化合物一般認(rèn)為由脂肪酸的氧化[28]或通過(guò)amadori途徑重排產(chǎn)生，通常閾值較低，可增強(qiáng)魚(yú)露香氣[29]，處理組中檢測(cè)出大量呋喃類化合物。酯類化合物通常在微生物的作用下由醇類和酸類物質(zhì)經(jīng)過(guò)酯化反應(yīng)等復(fù)雜的生化過(guò)程生成[30]，處理組1酯類的種類、數(shù)量較處理組2、處理組3、舟山商品魚(yú)露均有增加。肖宏艷[31]發(fā)現(xiàn)含硫化合物對(duì)魚(yú)露風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，處理組1、處理組2、處理組3均未檢測(cè)出含硫化合物，而舟山商品魚(yú)露中檢測(cè)出3-甲硫基丙醛，相對(duì)百分含量為3.09%，處理組1和處理組3均檢出具有魚(yú)腥味的三甲胺。烷烴類及其他化合物在處理組1、處理組2、處理組3、舟山商品魚(yú)露中相對(duì)百分含量分別為9.14%、11.88%、13.63%、0.13%。

2.4 魚(yú)露樣品感官評(píng)價(jià)分析

由圖6可知，處理組1、處理組2、處理組3及舟山商品魚(yú)露樣品的咸味、肉味、魚(yú)腥味差別不明顯，其中，處理組1魚(yú)露樣品干酪風(fēng)味和酸味略有不足，但其鮮味、水果香味均優(yōu)于處理組2和處理3，可能是接種SW5菌株發(fā)酵后產(chǎn)生的一些醇類、醛類化合物影響了魚(yú)露的風(fēng)味。此外，處理組3魚(yú)露樣品的腐臭味最大，可能是處理組3未經(jīng)過(guò)巴氏消毒，發(fā)酵液中存在大量腐敗微生物，即使在高滲透壓下仍能生產(chǎn)繁殖，導(dǎo)致處理組3腐臭味較大。

圖6 魚(yú)露樣品的感官評(píng)定雷達(dá)圖Fig.6 Radar plots depicting the flavor profiles of fish sauce products

3 討論

本研究表明，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株有2個(gè)產(chǎn)酶高峰期，分別在培養(yǎng)26 h和32 h，培養(yǎng)0～26 h時(shí)，該菌株分泌的胞外蛋白酶不斷在發(fā)酵液中積累，并在培養(yǎng)26 h時(shí)達(dá)到第一個(gè)產(chǎn)酶高峰期；至于第二個(gè)產(chǎn)酶高峰期，這在貝萊斯芽孢桿菌PS3全基因組(基因登錄號(hào)為L(zhǎng)N999829.1)中可以找到多條胞內(nèi)蛋白酶基因，正常情況下胞內(nèi)蛋白酶不會(huì)釋放至胞外，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，某些細(xì)胞可能產(chǎn)生裂解細(xì)胞壁的水解酶，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶釋放至胞外[32-33]。AA-N、TVB-N含量是衡量魚(yú)露品質(zhì)的重要指標(biāo)，其中，AA-N是以氨基酸形式存在的氮元素含量，該指標(biāo)越高，說(shuō)明魚(yú)露中氨基酸含量越高，鮮味越好[34]，能反映蛋白質(zhì)的水解程度及風(fēng)味特點(diǎn)[35]；TVB-N是以氨或胺類等形式存在的堿性含氮物質(zhì)，是反映原料魚(yú)和肉鮮度的主要指標(biāo)[36]，它的產(chǎn)生是在腐敗微生物或酶的作用下，將魚(yú)類加工副產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)或是非蛋白含氮化合物降解為揮發(fā)性的堿性胺或是氨。發(fā)酵4 d后處理組1發(fā)酵醪液AA-N含量增長(zhǎng)緩慢，可能是加鹽之后高滲透壓對(duì)該菌株所產(chǎn)蛋白酶活性有抑制作用，導(dǎo)致魚(yú)蛋白的水解速度放緩，發(fā)酵1～3 d時(shí)TVB-N含量增長(zhǎng)較快，可能與其處理方式有關(guān)。前期研究可知SW5菌株高產(chǎn)蛋白酶會(huì)將魚(yú)蛋白分解為氨基酸。貝萊斯芽孢桿菌PS3全基因組中可以找到多條脫羧酶和脫氫酶基因，魚(yú)露自然發(fā)酵前期，魚(yú)蛋白中的某些氨基酸在細(xì)菌脫羧酶、脫氫酶的作用下分解為甲胺、二甲胺、三甲胺等堿性含氮物質(zhì)[37]，從而導(dǎo)致TVB-N含量上升。因此，在使用SW5菌株發(fā)酵魚(yú)露初期，會(huì)造成TVB-N含量上升快，但感官評(píng)定結(jié)果顯示，接種發(fā)酵的魚(yú)露無(wú)不良風(fēng)味，可能是由于產(chǎn)生的三甲胺濃度低，不足以影響感官品質(zhì)。

本研究顯示，處理組1魚(yú)露中醇類化合物的相對(duì)百分含量高于處理組2和處理組3，與舟山商品魚(yú)露近似，由于醇類化合物的閾值相對(duì)較高，所以總體對(duì)魚(yú)露的風(fēng)味貢獻(xiàn)不明顯，但是可作為風(fēng)味形成的基礎(chǔ)物質(zhì)[38]。肖宏艷[31]在對(duì)潮汕魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，風(fēng)味化合物醇類、醛類、酸類和酮類在魚(yú)露發(fā)酵前期均被檢出，且醇類化合物含量較高，這與本研究結(jié)果較一致。魚(yú)露中的醛類化合物來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中的脂質(zhì)氧化[39]，由甘油二酯在脂肪酶作用下生成的游離脂肪酸進(jìn)一步氧化形成[1,40]。徐偉芳等[12]報(bào)道甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌在適宜條件下產(chǎn)生脂肪酶，而接種SW5菌株發(fā)酵后醛類化合物的種類、數(shù)量均大于未接種發(fā)酵和自然發(fā)酵，可能是SW5菌株產(chǎn)生的脂肪酶將甘油二酯酶解為游離脂肪酸，之后經(jīng)過(guò)進(jìn)一步氧化生成了醛類化合物。低分子量的揮發(fā)性酸構(gòu)成了魚(yú)露的干酪風(fēng)味，處理組1中酸類化合物的種類、相對(duì)百分含量較處理組2、處理組3和舟山商品魚(yú)露少，這與pH值、總酸含量和感官評(píng)價(jià)結(jié)果相互印證，處理組1中酸類化合物相對(duì)百分含量低可能是魚(yú)露陳釀時(shí)間較短，或是由該菌種產(chǎn)酸能力較弱造成的。而處理組2和處理組3的酸類化合物種類數(shù)量相當(dāng)，可能是由于巴氏消毒未完全殺死一些耐熱的產(chǎn)酸微生物，在適宜的條件下這些微生物又重新生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致處理組2中含有一定量的酸類化合物。舩津保浩等[41]研究發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性酸的存在對(duì)魚(yú)露的海鮮味有一定的促進(jìn)作用。Udomsil等[42]使用嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)發(fā)酵魚(yú)露時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌種能提高游離氨基酸和風(fēng)味物質(zhì)的含量，又能降低魚(yú)露生物胺含量，說(shuō)明外接微生物發(fā)酵可以有效改善發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，但原料來(lái)源不同、接種微生物不同、處理方式不同會(huì)使風(fēng)味結(jié)果產(chǎn)生巨大差異，因此結(jié)合多種風(fēng)味指紋圖譜是確定風(fēng)味成分的有效手段[43]。

本研究中，發(fā)酵第6天時(shí)，處理組1發(fā)酵醪液AA-N含量最高，為0.76 g·100 mL-1，表明SW5菌株產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)，可將魚(yú)蛋白迅速水解，但由于發(fā)酵時(shí)間短，魚(yú)露樣品中揮發(fā)性酸類化合物含量較低，且未檢測(cè)出3-甲硫基丙醛、二甲基二硫、二甲基三硫、丙酸、丁酸等對(duì)魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的化合物。為改善接種發(fā)酵法生產(chǎn)魚(yú)露的風(fēng)味，后續(xù)可采用分段式快速發(fā)酵魚(yú)露工藝[21]，即前期通過(guò)接種貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株使魚(yú)蛋白快速水解，再向發(fā)酵醪液中接種乳酸菌、產(chǎn)香酵母菌等進(jìn)行后期發(fā)酵，促進(jìn)魚(yú)露品質(zhì)成熟，提升魚(yú)露風(fēng)味[24]。

4 結(jié)論

本研究顯示，接種貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露，能加速魚(yú)蛋白分解，縮短魚(yú)露發(fā)酵生產(chǎn)周期。揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測(cè)結(jié)果顯示，接種SW5菌株發(fā)酵比未接種發(fā)酵和自然發(fā)酵具有更多種類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。因此，貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株可用作海洋蛋白質(zhì)源發(fā)酵精深加工的優(yōu)良微生物菌株，其產(chǎn)蛋白酶的分子機(jī)制、酶結(jié)構(gòu)與功能及酶解產(chǎn)物特性等有待進(jìn)一步研究。