關(guān)佳莉 王 剛 張夢(mèng)蕊 陳 曦 曹藝雯 唐曉清 王康才

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所，江蘇 南京 210095)

氮素作為植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)葉綠素、蛋白質(zhì)、核酸和部分激素等物質(zhì)的組成成分，在藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量與品質(zhì)的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]。菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)是大宗藥材板藍(lán)根與大青葉的基原植物。過(guò)量施用氮肥是其栽培生產(chǎn)上存在的主要問(wèn)題之一，不僅導(dǎo)致氮素利用效率下降、生產(chǎn)成本增加，引發(fā)生態(tài)環(huán)境污染等問(wèn)題，而且會(huì)對(duì)藥材產(chǎn)量及藥用品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[2-4]。因此，合理施用氮肥是獲取高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藥材的重要環(huán)節(jié)，即對(duì)藥用植物而言，應(yīng)在不顯著降低其產(chǎn)量的條件下，適當(dāng)減少氮肥施用量，以保證藥材品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本和保護(hù)環(huán)境。

減量施氮對(duì)作物的影響已有大量報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)減量施氮不僅未影響甘藍(lán)[5]、小麥[6]、水稻[7]等作物的產(chǎn)量，還減少了氮肥損失，提高了氮肥利用率。目前，有關(guān)菘藍(lán)營(yíng)養(yǎng)生理的研究主要集中在氮素形態(tài)、施氮方式對(duì)其的影響[8-10]，而關(guān)于低氮營(yíng)養(yǎng)下菘藍(lán)生長(zhǎng)與活性成分積累響應(yīng)的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用盆栽試驗(yàn)，研究不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)生物量積累、光合參數(shù)、碳氮代謝及藥材質(zhì)量的影響，以期闡明菘藍(lán)對(duì)低氮環(huán)境的生理響應(yīng)，為生產(chǎn)實(shí)踐中科學(xué)合理施氮、獲取優(yōu)質(zhì)藥材提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為來(lái)自山西的菘藍(lán)栽培居群，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所王康才教授鑒定為十字花科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的角果(生產(chǎn)上稱為種子)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年7-12月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行。采用育苗移栽方式，挑選籽粒飽滿、大小均勻的種子播于穴盤(pán)中，出苗后每10 d澆施一次1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(氮濃度為3.75 mmol·L-1)，每次500 mL?；A(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液中，大量元素與微量元素采用改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液pH值 6.0。待幼苗真葉長(zhǎng)至4～5片時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的植株，轉(zhuǎn)移至盆栽(外口徑29.6 cm，底直徑 17.8 cm，高19.7 cm)中，栽培基質(zhì)由蛭石和珍珠巖(蛭石∶珍珠巖=2∶1)混合而成。每盆定苗5株。各處理重復(fù)8次，共40盆，隨機(jī)排列。播種40 d后開(kāi)始處理，每隔7 d澆灌1次處理營(yíng)養(yǎng)液，于2017年12月10日收獲。

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)氮素水平，分別為0(記作N0)、2.5(記作N1)、5.0(記作N2)、10.0(記作N3)、15.0 mmol·L-1(記作CK)。處理營(yíng)養(yǎng)液均加入硝化抑制劑雙氰胺，用量為處理液中純氮含量的0.4%。不同處理中大量元素配比如表1所示。

表1 不同處理中大量元素配比Table 1 The major elements ratio in different treatments /(mmol·L-1)

注：“—”表示處理營(yíng)養(yǎng)液中不含列表中對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分。

Note: ‘—’ indicates that the chemical components in the nutrient solution are not included in the list.

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生物量測(cè)定 各處理隨機(jī)選取10株，清水洗凈后用滅菌的濾紙吸干水分，將地上部分與地下部分分開(kāi)，根和葉均經(jīng)105℃殺青15 min，然后60℃烘干至恒重，分別稱量單株根與葉的干重。并將葉、根的干樣分別粉碎后過(guò)60目篩，備用。按照公式計(jì)算根冠比：

根冠比=單株根干質(zhì)量/單株葉干質(zhì)量

(1)。

1.3.2 游離氨基酸含量的測(cè)定 采用茚三酮顯色法[11]。分別稱取菘藍(lán)根、葉的干樣各0.1 g于試管中，每處理3次重復(fù)，加入10 mL蒸餾水，然后沸水浴20 min，冷卻后過(guò)濾，保留上清液。向沉淀中加入5 mL蒸餾水，然后沸水浴10 min，過(guò)濾并反復(fù)沖洗殘?jiān)?，合?次的上清液并定容至25 mL。取4支潔凈干燥的試管，其中3支分別加入0.5 mL稀釋過(guò)的樣品提取液，1支加入0.5 mL蒸餾水，分別在上述4支試管中加入醋酸緩沖液、水合茚三酮各0.5 mL，混勻后蓋塞并沸水浴12 min，冷卻后再分別加入5 mL 95%乙醇，搖勻。以空白作參比，于波長(zhǎng)570 nm下測(cè)定吸光度值，并計(jì)算游離氨基酸含量。

1.3.3 硝態(tài)氮含量的測(cè)定 采用水楊酸-硫酸法[11]。樣品提取步驟與游離氨基酸相同。吸取0.1 mL樣品液，加入0.4 mL 5%水楊酸-硫酸溶液，混勻后于室溫下放置20 min，緩慢加入9.5 mL 8% NaOH溶液，待冷卻至室溫后，以空白作參比，于410 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。用標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出0.1 mL樣品提取液中硝態(tài)氮含量，再計(jì)算樣品中的硝態(tài)氮含量。

1.3.4 可溶性糖含量的測(cè)定 采用蒽酮比色法[11]。樣品提取步驟與游離氨基酸相同。吸取稀釋過(guò)的樣品提取液0.5 mL于20 mL刻度試管中，重復(fù)3次，加入1.5 mL蒸餾水。然后加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯試劑，再緩慢加入5 mL濃硫酸，充分振蕩后立即放入沸水浴中準(zhǔn)確保溫1 min，(比色空白用2 mL蒸餾水與0.5 mL蒽酮試劑混合，并一同于沸水浴保溫)。取出后冷卻至室溫，以空白作參比，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算可溶性糖含量。

1.3.5 光合參數(shù)的測(cè)定 于晴朗、陽(yáng)光充足的天氣，選擇菘藍(lán)植株由內(nèi)至外的第3片功能葉，于2017年12月9日上午9:00-11:00進(jìn)行光合參數(shù)測(cè)定。采用 LI-6400便攜式光合作用測(cè)量系統(tǒng)(LI-COR公司，美國(guó))測(cè)定葉片的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)和蒸騰速率(transpiration rate，Tr)。測(cè)定時(shí)使用開(kāi)放式氣路，采用紅藍(lán)光源，光通量密度為1 000 μmol·m-2·s-1。

1.3.6 葉中靛藍(lán)和靛玉紅含量的測(cè)定 參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[4]的方法提取菘藍(lán)葉中的靛藍(lán)、靛玉紅，應(yīng)用超高效液相色譜法測(cè)定其含量。色譜條件：Agilent 超高效液相色譜儀。流動(dòng)相為v(甲醇)∶v(水)=72∶28；流速0.300 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為289 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣體積2 μL。采用外標(biāo)法計(jì)算葉中靛藍(lán)和靛玉紅含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，用甲醇溶解后均定容至50 mL，搖勻后用孔徑0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。臨用前，用甲醇溶液采用逐級(jí)稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列質(zhì)量濃度的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取靛藍(lán)、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液各2 μL進(jìn)行測(cè)定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=16.022x+21.742，r2=0.999 4(n=3)，線性范圍0～2 μg·mL-1；靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=157.32x-9.329 4，r2=0.999 8(n=3)，線性范圍0～10 μg·mL-1。

供試品溶液制備：準(zhǔn)確稱取0.25 g葉粉末于索氏提取器中，加入適量三氯甲烷，浸泡15 h，加熱回流提取至提取液無(wú)色?；厥杖軇┱舾?，殘?jiān)蛹状际蛊淙芙?，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，補(bǔ)充甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.3.7 根中(R,S)-告依春含量的測(cè)定 參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[4]的方法提取菘藍(lán)根中的(R,S)-告依春，并采用高效液相色譜法測(cè)定其含量。色譜條件：HITACHI D2000高效液相色譜系統(tǒng)(日立公司，日本)。流動(dòng)相為 v(甲醇)∶v(0.02%磷酸溶液)=20∶80；流速0.600 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣體積20 μL。采用外標(biāo)法計(jì)算根中(R，S)-告依春含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取1.0 mg(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成40 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品母液。微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，備用。臨用前，用甲醇溶液采用逐級(jí)稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL-1的(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取20 μL進(jìn)行測(cè)定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=116.93x-10.091，r2=0.999 8(n=3)，線性范圍0～40 μg·mL-1。

供試品溶液制備：準(zhǔn)確稱取0.5 g根粉末于圓底瓶中，加入25 mL蒸餾水，稱定重量，煎煮2 h，待冷卻后稱定其重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.3.8 葉中總黃酮含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.100 0 g菘藍(lán)葉粉末，加入10 mL 70%乙醇，超聲波振蕩1 h后過(guò)濾，將濾液定容至25 mL，混勻。吸取2 mL濾液于試管內(nèi)，加入0.5 mL 50 g·L-1NaNO2，搖勻后靜置6 min，再加入0.5 mL 100 g·L-1Al(NO3)3，搖勻后靜置6 min，然后加入4 mL 40 g·L-1NaOH，最后用70%乙醇定容至10 mL。搖勻后靜置15 min，于510 nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)定吸光度值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 7x+0.002 2，r2=0.999 5(n=3)，線性范圍0～40 μg·mL-1，計(jì)算葉中總黃酮含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析 采用 Microsoft Office Excel 2013、SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan′s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)生物量積累的影響

由表2可知，隨著氮素濃度的增加，菘藍(lán)葉干重逐漸增加，其中CK顯著高于其他處理(P<0.05)。根干重隨著氮素濃度的增加而增加，但N0與N1之間、N3與CK之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。單株干重的變化規(guī)律與葉、根干重的變化趨勢(shì)基本一致，N0、N1、N2、N3處理的單株干重與CK相比，分別顯著降低了91.0%、82.4%、52.8%、14.6%。根冠比隨著氮素濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，依次表現(xiàn)為N1>N2>N3>N0>CK。表明在低氮條件下，菘藍(lán)根與葉的生長(zhǎng)均受到一定程度的抑制，氮素濃度降低到一定水平時(shí)促使植株的根冠比增加，對(duì)菘藍(lán)地下部分生長(zhǎng)的促進(jìn)作用大于地上部分。

2.2 不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)可溶性糖、游離氨基酸、硝態(tài)氮含量的影響

由表3可知，N0處理下的菘藍(lán)葉中可溶性糖含量最高，且顯著高于其他處理(P<0.05)，隨著氮素濃度的增加，葉中可溶性糖含量呈先減少后增加的趨勢(shì)，而根中可溶性糖含量的變化規(guī)律與葉中存在差異；在N1～CK范圍內(nèi)，根中可溶性糖含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，N2處理下根中可溶性糖含量顯著高于其他處理(P<0.05)，N0與N3之間無(wú)顯著差異。葉中游離氨基酸含量隨著氮素濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，在N3處理下達(dá)到最大值，N3與CK間無(wú)顯著差異(P>0.05)；根中游離氨基酸含量變化趨勢(shì)與葉中相同，于N3處理下達(dá)到最大值。葉中硝態(tài)氮含量隨著氮素濃度的增加呈先減少后增加的趨勢(shì)，其中N3處理的硝態(tài)氮含量顯著低于其他處理；根中硝態(tài)氮含量變化趨勢(shì)與葉中一致，但同一氮素濃度下，葉中硝態(tài)氮含量均高于根。

表2 不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)根與葉干重及根冠比的影響Table 2 Effect of different nitrogen levels on dry weight and root to shoot ratio of I. indigotica

注：同列不同字母表示各處理間在5%水平差異顯著。下同。

Note: Different letters in the same column indicate significant difference among different treatments at 0.05 level. The same as following.

表3 不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)根與葉中可溶性糖、游離氨基酸、硝態(tài)氮含量的影響Table 3 Effect of different nitrogen levels on contents of soluble sugar, free amino acid and nitrate nitrogen in leaves and roots of I. indigotica /(mg·g-1DW)

2.3 不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)光合參數(shù)的影響

由圖1可知，隨著氮素濃度的增加，菘藍(lán)葉片的Pn呈先升高后降低的趨勢(shì)，N2、N3、CK間差異不顯著，但均顯著高于N0、N1(P<0.05)；Gs也呈先升高后降低的趨勢(shì)；葉片Tr的變化規(guī)律與Gs一致；而Ci則呈逐漸降低的趨勢(shì)。表明氮素濃度過(guò)低不利于菘藍(lán)植株進(jìn)行光合作用。

2.4 不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)活性成分的影響

由表4可知，不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)葉中靛藍(lán)、靛玉紅含量的影響存在差異。靛藍(lán)含量隨著氮素濃度的增加逐漸增加，N3和 CK下的靛藍(lán)含量均顯著高于其他處理(P<0.05)，但二者間無(wú)顯著差異。靛玉紅含量則隨著氮素的濃度增加呈先減少后增加的趨勢(shì)，低氮條件下的靛玉紅含量較高。根中(R,S)-告依春的含量隨著氮素濃度的增加呈先增加后減少的趨勢(shì)，在N3處理下達(dá)到最高。葉中總黃酮含量隨著氮素濃度的增加而逐漸減少，N0處理下達(dá)到最高，N0與N1間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但二者的總黃酮含量均顯著高于其他處理(P<0.05)，且N2、N3、CK間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

由表5可知，隨著氮濃度的增加，葉中靛藍(lán)、靛玉紅、總黃酮單株產(chǎn)量均呈上升的趨勢(shì)，且均在CK處理達(dá)到最高。與CK相比，N3處理下的靛藍(lán)、靛玉紅、總黃酮單株產(chǎn)量分別下降了23.4%、20.4%、15.4%；N0處理下的靛藍(lán)、靛玉紅、總黃酮單株產(chǎn)量分別下降了97.5%、89.7%、90.5%。根中(R,S)-告依春?jiǎn)沃戤a(chǎn)量則隨著氮濃度的增加呈先增加再減少的趨勢(shì)，在N3處理下達(dá)到最高，與CK相比，N3處理的(R,S)-告依春?jiǎn)沃戤a(chǎn)量增加了43.2%。

2.5 菘藍(lán)生物量與活性成分指標(biāo)間相關(guān)性分析

對(duì)各處理的菘藍(lán)生物量與活性成分指標(biāo)間進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。由表6可知，葉干重與根干重呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.991。葉干重與總黃酮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.990。靛藍(lán)含量與靛玉紅、總黃酮含量之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.974、-0.969。綜上表明，氮素對(duì)于不同活性成分的調(diào)控特點(diǎn)存在差異。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant different at 0.05 level.圖1 不同供氮水平對(duì)菘藍(lán)光合參數(shù)的影響Fig.1 Effect of different nitrogen levels on photosynthetic parameters of I. indigotica

表5 不同供氮水平下菘藍(lán)主要活性成分的單株產(chǎn)量Table 5 The yield per plant of the main active components under different nitrogen levels

表6 菘藍(lán)生物量與活性成分指標(biāo)間相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis among biomasses and active components indexes in I. indigotica under different nitrogen levels

注：*表示在0.05水平相關(guān)性顯著；**表示在0.01水平相關(guān)性極顯著。

Note:*indicates correlation is significant at 0.05 level.**indicates correlation is extremely significent.

3 討論

3.1 菘藍(lán)生長(zhǎng)對(duì)不同供氮水平的響應(yīng)

氮素是植物生長(zhǎng)與代謝過(guò)程中的重要影響因子，氮素不足時(shí)植株矮小且生長(zhǎng)緩慢，氮素充足時(shí)植株生長(zhǎng)較為旺盛，但氮素過(guò)量會(huì)對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[12]。研究表明，氮素對(duì)植物生物量積累和產(chǎn)量形成具有促進(jìn)效應(yīng)。張?jiān)骑L(fēng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)隨著氮濃度的增大，擬巫山淫羊藿的單株生物量和葉干重均顯著升高。盧麗蘭等[14]研究表明，高氮有利于廣藿香生長(zhǎng)，可顯著提高其單株重量，這與本研究結(jié)果相同。本研究中，菘藍(lán)根與葉的干重均隨著氮素濃度的增加而增加，且CK的葉干重顯著高于其他處理，但CK的根鮮重、根干重與N3之間無(wú)明顯差異，表明適當(dāng)減少氮素供給，對(duì)菘藍(lán)根生物量積累影響較小，但氮素供應(yīng)過(guò)少會(huì)抑制根與葉的生物量積累。本研究還發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)地上部分與根系在低氮營(yíng)養(yǎng)下的響應(yīng)存在差異，其根冠比隨著氮素濃度增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，在N1處理下達(dá)到最大值。這是由于在氮素供應(yīng)水平較低時(shí)，植物分配至地下部分的光合產(chǎn)物比例增加，相對(duì)提高根系生物量來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化，以獲取更多養(yǎng)分，從而增大根冠比。低氮條件下，植株根冠比增加可能屬于植物耐氮素脅迫的機(jī)制之一。

3.2 菘藍(lán)碳氮代謝對(duì)不同供氮水平的響應(yīng)

供氮水平對(duì)于植物體的碳氮代謝也存在顯著影響。孫興祥等[15]研究表明，菠菜中的可溶性糖含量隨氮素濃度的降低呈上升趨勢(shì)；張梅等[16]研究發(fā)現(xiàn)甜菜生長(zhǎng)發(fā)育前期，隨著施氮量的增加，葉片可溶性糖積累量整體上呈先降低后升高的趨勢(shì)，中期逐漸下降，這與本研究結(jié)果相似。本研究中，菘藍(lán)葉的可溶性糖含量隨著氮素濃度的增加而呈先減少后增加的趨勢(shì)，在N0處理達(dá)到最大值，根中可溶性糖含量在2.5～15.0 mmol·L-1范圍內(nèi)呈先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是由于氮素濃度較高時(shí)，植株代謝較旺盛，大量可溶性糖轉(zhuǎn)化為碳架，導(dǎo)致可溶性糖含量下降。硝態(tài)氮和氨基酸含量在一定程度上可反映植物的氮素代謝情況。前人研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下，大豆葉與根系中硝態(tài)氮、游離氨基酸含量均低于正常氮素處理[17]，這與本研究結(jié)果相似。本研究中，菘藍(lán)葉與根中游離氨基酸含量變化趨勢(shì)一致，均隨著氮素濃度的增加而呈先增加后減少的趨勢(shì)，在N3處理下達(dá)到最大值；菘藍(lán)葉與根中的硝態(tài)氮含量則表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(shì)，N3處理的硝態(tài)氮含量顯著低于其他處理。氮素濃度較大時(shí)硝態(tài)氮含量低，可能是由于氮素濃度高，植物體內(nèi)氮代謝關(guān)鍵酶活性較高，促進(jìn)了無(wú)機(jī)氮向有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，使得硝態(tài)氮的還原量大于吸收量。而在低氮條件下，氮代謝酶活性較低，硝態(tài)氮積累相對(duì)較多，導(dǎo)致其含量升高。同一供氮水平下葉中硝態(tài)氮含量高于根中硝態(tài)氮含量，可能是由于被吸收的硝態(tài)氮部分被根系直接轉(zhuǎn)化，大量硝態(tài)氮被轉(zhuǎn)移至葉片中。

3.3 菘藍(lán)光合參數(shù)對(duì)不同供氮水平的響應(yīng)

供氮水平對(duì)于植物的光合作用有較大影響?？嵇Q凌等[18]研究表明，過(guò)低的氮素水平會(huì)導(dǎo)致喜樹(shù)幼苗光合作用能力下降；李強(qiáng)等[19]研究發(fā)現(xiàn)在低氮脅迫下，苗期玉米葉片的Pn、Gs、Tr顯著降低，Ci顯著增加。本研究中，菘藍(lán)的Pn、Tr、Gs均隨著氮素濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，Ci呈逐漸降低趨勢(shì)，這與許楠等[20]的研究結(jié)果類(lèi)似。植物碳代謝和氮代謝相互影響與制約，氮素供應(yīng)水平過(guò)高導(dǎo)致光合能力下降，可能是由于植物碳代謝與氮代謝均需要同化力及碳架。植物中氮素含量升高使氮同化作用增強(qiáng)，與光合碳同化競(jìng)爭(zhēng)同化力，導(dǎo)致CO2同化速率降低。此外，氮同化加強(qiáng)后，呼吸作用向光合碳同化提供碳架的能力減弱，使CO2同化速率下降[17]。植物光合作用屬于碳代謝的一部分，與同化產(chǎn)物在植物體內(nèi)的分配與積累過(guò)程有一定內(nèi)在聯(lián)系。當(dāng)植物氮素缺乏時(shí)，葉片Pn較低，葉中可溶性糖含量積累較多；在氮素充足時(shí)，植物向葉片投入較多氮營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)光合能力的提高，植物對(duì)于營(yíng)養(yǎng)的需求增加，進(jìn)而向根系分配較多光合產(chǎn)物以促進(jìn)根系生長(zhǎng)，增強(qiáng)根系對(duì)氮素的吸收，植株氮代謝活動(dòng)旺盛，硝態(tài)氮含量降低。影響植物光合作用的主要因素為氣孔限制和非氣孔限制，葉片Pn、Gs和Ci同時(shí)下降，說(shuō)明Pn下降主要因?yàn)闅饪滓蛩?，而Pn、Gs下降、Ci升高說(shuō)明非氣孔限制是Pn降低的主要限制因素[21]。本研究中，N0～N3范圍內(nèi)，隨著氮濃度的減小，菘藍(lán)Pn、Gs、Tr均降低，Ci呈升高趨勢(shì)，Pn與Tr、Gs均呈極顯著正相關(guān)，與Ci間呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明菘藍(lán)光合作用主要受非氣孔因素限制。

3.4 菘藍(lán)活性成分對(duì)不同供氮水平的響應(yīng)

藥用植物的藥效成分大多數(shù)為次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物是植物在與外界環(huán)境相互作用的過(guò)程中逐漸形成的，其形成除與遺傳因素有關(guān)外，主要還受到生態(tài)因子的影響[22]。氮素可能通過(guò)影響植物中的碳氮代謝，也可能通過(guò)影響次生代謝過(guò)程的酶系統(tǒng)等方面，來(lái)調(diào)控植物的次生代謝途徑，影響次生代謝產(chǎn)物含量[23]。兼顧藥用植物產(chǎn)量及品質(zhì)是生產(chǎn)實(shí)踐中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，施用氮肥應(yīng)考慮菘藍(lán)生長(zhǎng)與其次生代謝產(chǎn)物積累的平衡。

大多數(shù)生物堿屬于含氮化合物，其代謝途徑較為復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)氮素對(duì)于生物堿的生物合成與積累有促進(jìn)作用。丁麗潔等[24]研究表明，在一定氮素濃度范圍內(nèi)，黃檗中小檗堿、藥根堿和掌葉防己堿均隨著氮素濃度增加而增加。朱孟炎等[25]研究表明，低氮水平下，長(zhǎng)春花葉片中的文朵靈、長(zhǎng)春質(zhì)堿、長(zhǎng)春堿含量均顯著低于正常和高氮水平。本研究中，菘藍(lán)葉中靛藍(lán)含量隨著氮素濃度的增加逐漸增加，根中(R,S)-告依春含量隨著氮素濃度的呈先增后減少的趨勢(shì)，在N3處理下達(dá)到最高。但也有研究表明，氮素脅迫條件刺激了植物體內(nèi)某些次生代謝物質(zhì)的合成，使部分生物堿成分含量提高。孫世芹等[26]研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)偷{迫能夠顯著增加喜樹(shù)幼苗中的喜樹(shù)堿含量。本研究中，菘藍(lán)葉中靛玉紅含量隨著氮素濃度的增加表現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(shì)。靛玉紅和靛藍(lán)屬于吲哚類(lèi)生物堿，(R,S)-告依春為含硫類(lèi)生物堿，這3類(lèi)成分均為含氮次生代謝物。適當(dāng)?shù)牡毓?yīng)有利于菘藍(lán)中靛藍(lán)與(R,S)-告依春的積累，而低氮條件促進(jìn)了靛玉紅含量增加。根中(R,S)-告依春?jiǎn)沃戤a(chǎn)量在N3處理下達(dá)到最高，表明適當(dāng)降低施氮量，可以獲得活性成分含量較高的板藍(lán)根。通過(guò)調(diào)節(jié)氮素水平可以調(diào)控藥用植物部分次生代謝產(chǎn)物的水平，為生產(chǎn)上獲得高品質(zhì)藥材提供了可能的途徑。

氮素對(duì)黃酮類(lèi)化合物的合成代謝過(guò)程也有一定調(diào)控作用。菘藍(lán)葉中總黃酮含量隨著氮素濃度的降低呈逐漸增加的趨勢(shì)，0～5 mmol·L-1氮濃度范圍內(nèi)的總黃酮含量顯著高于其他處理。研究表明，在低氮環(huán)境下，黃酮與異黃酮合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，可以通過(guò)氮素來(lái)調(diào)控黃酮類(lèi)化合物的含量[27]。L?vdal等[28]研究發(fā)現(xiàn)在低氮條件下，番茄葉片中黃酮成分槲皮素、山奈酚及鼠李素的含量均有所升高，這與本研究結(jié)果相似。Liu等[29]研究表明，缺氮可使菊花葉片的黃酮含量保持在較高水平；向達(dá)兵等[30]研究發(fā)現(xiàn)施氮會(huì)顯著降低苦蕎麥中的蘆丁含量，但對(duì)槲皮素含量無(wú)顯著影響。上述結(jié)果表明，降低氮素濃度有利于植物中黃酮類(lèi)成分的合成。在低氮條件下，不同植物中生物堿與黃酮類(lèi)成分的響應(yīng)存在差異，且菘藍(lán)中靛藍(lán)含量與靛玉紅、總黃酮含量之間均呈極顯著負(fù)相關(guān)，這可能與植物自身營(yíng)養(yǎng)特性有關(guān)，也可能與次生代謝產(chǎn)物復(fù)雜的合成過(guò)程有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，氮素供應(yīng)水平對(duì)菘藍(lán)生長(zhǎng)及藥材質(zhì)量有顯著影響。氮素濃度在0～5 mmol·L-1范圍內(nèi)，菘藍(lán)根與葉生物量積累及光合作用均受到一定程度的抑制。適當(dāng)?shù)牡毓?yīng)有利于菘藍(lán)中靛藍(lán)與(R,S)-告依春積累，而降低氮素濃度有利于增加靛玉紅與總黃酮含量。根中(R,S)-告依春?jiǎn)沃戤a(chǎn)量在N3(10 mmol·L-1)處理下達(dá)到最高，可以通過(guò)適當(dāng)降低氮素濃度獲得活性成分含量較高的板藍(lán)根。在實(shí)際田間栽培生產(chǎn)中，為獲得產(chǎn)量穩(wěn)定、品質(zhì)較好的藥材，可以考慮適當(dāng)降低氮肥用量，調(diào)控菘藍(lán)部分次生代謝產(chǎn)物的水平，以獲得高品質(zhì)藥材，但具體減量施氮措施還有待進(jìn)一步研究。