覃輝艷 陳華鳳 王 芳 楊 慧 李 彬 張潔宏

(廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧 530028)

實驗動物在生命科學(xué)研究中占有重要地位，實驗動物的質(zhì)量，特別是遺傳質(zhì)量，直接影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和重復(fù)性。近交系小鼠因其在實驗中所表現(xiàn)出的一致性、再現(xiàn)性和敏感性，在科學(xué)研究中尤其是遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)研究有著不可替代的重要地位[1]。一直以來，對近交系小鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測常以生化標(biāo)記法、免疫標(biāo)記法等為主，大多為以檢測表型變異推測基因變異，存在一定局限性。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對近交系小鼠直接進行基因檢測，則能更直接更有效地反應(yīng)其遺傳質(zhì)量。微衛(wèi)星 DNA(microsatellite DNA)，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)或簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)，是均勻分布于真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列，由2～6個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成。具有分布廣泛、多態(tài)性豐富、易于檢測、呈共顯性遺傳、結(jié)果穩(wěn)定可靠等特點，被認為是各類遺傳標(biāo)記檢測中最有價值的一種。目前，國內(nèi)已有學(xué)者利用微衛(wèi)星標(biāo)記檢測技術(shù)開展近交系小鼠遺傳質(zhì)量分析研究，但與傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進行比較分析尚少見報道。因此，本研究應(yīng)用20個微衛(wèi)星位點對近交系BALB/c小鼠進行檢測，同時采用現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)生化標(biāo)記法進行檢測比較分析，驗證微衛(wèi)星遺傳檢測方法的可靠性，為該技術(shù)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠共10只，為BALB/cAn亞系，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心繁殖，生產(chǎn)許可證號：SCXK(桂)2014-0002。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：Sigma高速冷凍離心機；Bio-Rad電泳儀；GelDoc-It2凝膠成像分析儀；ABI梯度PCR儀；ABI 3730XL測序儀等。

試劑：Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit核酸提取試劑盒；Takara Premix Ex TaqTMHot Start Version PCR反應(yīng)試劑盒；實驗小鼠遺傳檢測試劑盒等。

1.3 方法

1.3.1微衛(wèi)星DNA檢測

1.3.1.1 核酸樣品制備：用滅菌剪刀剪取小鼠長約0.6 cm的尾尖組織，剪碎，置于1.5 mL的無菌離心管中。使用Qiagen公司貨號為69504的試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit(50)提取核酸。核酸提取后采用ND-1000 紫外分光光度計分析提取核酸的純度和濃度。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品是否含有主帶。

1.3.1.2 微衛(wèi)星位點選取與引物合成：根據(jù)文獻[1-2]和最新MMDBJ數(shù)據(jù)庫提供的信息，選擇等位基因數(shù)多、多態(tài)性含量豐富的20個微衛(wèi)星位點，覆蓋小鼠的20條染色體，各位點引物使用FAM標(biāo)記，由華大基因合成。引物編號和序列見表1。

表1 20 個近交系小鼠微衛(wèi)星位點的 擴增條件和染色體分布Table 1 Amplification conditions and chromosome distribution of 20 inbred mice microsatellite loci

1.3.1.3 PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq Hot Start Version 10 μL、模板1 μL、10 μmol/L正向引物0.5 μL、10 μmol/L反向引物0.5 μL、無酶水補足至20 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s，最佳退火溫度(見表1)30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次，72 ℃保持10 min。

1.3.1.4 毛細管電泳：將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取9 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物，使用ABI 3730XL測序儀進行毛細管電泳。

1.3.2近交系小鼠生化標(biāo)記檢測:參照GB/T 14927.1—2008 《近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測法》進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1微衛(wèi)星DNA檢測:利用Genemarker 中的Fragment(Plant)片段分析軟件對測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小數(shù)據(jù)。

1.4.2生化標(biāo)記檢測: 與標(biāo)準(zhǔn)條帶進行對照判讀。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測

各樣品各檢測位點毛細管電泳檢測的片段大小見表2。各樣品各檢測位點DNA片段大小相同，沒有新的等位基因出現(xiàn)，符合近交系要求。

表2 各樣品各微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果

Table2Themicrosatellitemarkerresultsofeachsample

檢測位點片段大小/bp1號2號3號4號5號6號7號8號9號10號D1Mit3183183183183183183183183183183D2Mit15139139139139139139139139139139D3Mit29202202202202202202202202202202D4Mit1388888888888888888888D5Mit13174174174174174174174174174174D6Mit1245245245245245245245245245245D7Mit228136136136136136136136136136136D8Mit33222222222222222222222222222222D9Mit90130130130130130130130130130130D10Mit12238238238238238238238238238238D11Mit4246246246246246246246246246246D12Mit2133133133133133133133133133133D13Mit3187187187187187187187187187187D14Mit5179179179179179179179179179179D15Mit179154154154154154154154154154154D16Mit79132132132132132132132132132132D17Mit11148148148148148148148148148148D18Mit64169169169169169169169169169169D19Mit16132132132132132132132132132132DXMit1693939393939393939393

2.2 生化標(biāo)記檢測

Akp1等14個生化標(biāo)記基因均為純合，個體間生化標(biāo)記表型均一致，且根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，符合品系特征, 見表3。

表3 各樣品各生化標(biāo)記位點檢測結(jié)果Table 3 The biochemical marker results of each sample

注：a表示：在Ce2、Mod1、Pgm1位點為快帶，在Es3、Es10、Gpi1、Idh1、Pep3位點為慢帶；b表示：在Car2、Gpd1位點為快帶，在Akp1、Es1、Trf位點為慢帶；d表示：在Hbb位點為慢帶。

Note：a represent fast band at loci Ce2, Mod1 and Pgm1, and slow band at loci Es3, Es10, Gpi1, Idh1 and Pep3.b represent fast band at loci Car2 and Gpd1, and slow band at loci Akp1, Es1 and Trf.d represent fast band at locus Hbb.

3 討論

近交系是經(jīng)至少連續(xù)20代的全同胞兄妹或親代與子代交配培育而形成的具有穩(wěn)定性狀特征和繁殖能力的實驗動物品系。按照國家標(biāo)準(zhǔn)要求，近交系動物近交系數(shù)應(yīng)大于99%。BALB/c小鼠是目前生命科學(xué)研究中最廣泛應(yīng)用的近交系之一，各國均有生產(chǎn)和應(yīng)用。我國于1985年從美國NIH引進到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，為BALB/c第180代，歷經(jīng)多年培育，至今已在國內(nèi)形成幾十個群體。因群體數(shù)量較多，對相應(yīng)群體進行遺傳檢測分析，不僅可了解其遺傳質(zhì)量，建立其遺傳背景資料，且可闡明使用不同BALB/c小鼠群體進行實驗的重復(fù)性和可比性。

微衛(wèi)星DNA標(biāo)記是繼RFLP(限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性)技術(shù)之后發(fā)展起來的新一代分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，自20世紀(jì)80年代以來，經(jīng)過30年的不斷發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定、人類疾病診斷、實驗動物遺傳質(zhì)量分析、生物群體遺傳結(jié)構(gòu)與物種資源保護等多領(lǐng)域[3]。目前，微衛(wèi)星DNA的PCR產(chǎn)物分型檢測方法主要有瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺電泳法、熒光標(biāo)記引物毛細管電泳法、基于擴增子測序的分型法等[4]。王洪等[1]、劉先菊等[5]與王越甲等[6]分別采用瓊脂糖凝膠電泳法優(yōu)選近交系小鼠微衛(wèi)星基因位點分析了國內(nèi)常用近交系小鼠的遺傳概貌。陳振文等[7]、歐陽兆和等[8]與韓喜彬等[9]分別運用微衛(wèi)星標(biāo)記和聚丙烯酰胺電泳法對國內(nèi)近交系小鼠進行了遺傳質(zhì)量分析。近年來，倪麗菊等[2]和李銀銀等[10]分別利用微衛(wèi)星標(biāo)記和毛細管電泳法分析了國內(nèi)多個品系近交系小鼠的遺傳狀況。毛細管電泳又稱高效毛細管電泳，是一種高效液相分離法，是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物，離子或荷電粒子以電場為驅(qū)動力，在毛細管中按其淌度或和分配系數(shù)不同進行高效快速分離。與傳統(tǒng)電泳法操作繁瑣，分離率低、定量困難相比，毛細管電泳具有易自動化、分析速度快、分離效率高、定量準(zhǔn)確、操作方便等優(yōu)點。本研究采用20個多態(tài)性含量豐富的微衛(wèi)星位點，采用熒光標(biāo)記引物毛細管電泳法對BALB/c小鼠進行遺傳質(zhì)量分析，研究結(jié)果顯示，各樣品20個微衛(wèi)星位點DNA片段大小相同，沒有新的等位基因出現(xiàn)，生化標(biāo)記檢測結(jié)果亦顯示Akp1等14個生化標(biāo)記基因均為純合，個體間生化標(biāo)記表型均一致，且符合國家標(biāo)準(zhǔn)確定的品系特征。微衛(wèi)星DNA檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的生化標(biāo)記檢測結(jié)果一致，比對結(jié)果顯示，微衛(wèi)星DNA檢測可應(yīng)用于實驗動物遺傳質(zhì)量評價，且微衛(wèi)星DNA檢測比生化標(biāo)記檢測覆蓋面更廣，熒光標(biāo)記引物毛細管電泳法檢測結(jié)果更準(zhǔn)確，更能直接有效地反應(yīng)實驗動物的遺傳質(zhì)量。近年來的研究也表明微衛(wèi)星DNA標(biāo)記可區(qū)分近交系小鼠不同品系和亞系，可有效運用于近交系小鼠遺傳檢測[1-2,5-10]。但目前，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)仍存在一些問題，如無效等位基因的出現(xiàn)，在純合體個體上，無效等位基因表現(xiàn)為無可見的擴增條帶，通常會被認為是因PCR技術(shù)或DNA模板質(zhì)量問題而被忽視[11]；此外，由于使用引物的不同，有時會導(dǎo)致所得試驗結(jié)果差異較大。因此，在行業(yè)內(nèi)，選定相應(yīng)引物，并形成相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)非常必要。