楊 林 黎桂玲 劉 科 代路路 李金鳳 朱葉萌 鄺少松

(1.廣東省醫(yī)學實驗動物中心，佛山 528248)(2.華南農(nóng)業(yè)大學，廣州 510642)

動物體內(nèi)的脂類物質(zhì)代謝異常時，多余的脂質(zhì)會沉積在血管壁上，并逐漸形成斑塊，使血管內(nèi)皮增厚、變硬，是引起動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的重要原因之一。載脂蛋白E(apolipoprotein E, apoE)主要存在于乳糜微粒(chylomicron, CM)、極低密度脂蛋白(very low desity lipoprotein, LDL)等多種血漿脂蛋白中，可介導脂蛋白殘粒的攝取，維持血漿膽固醇的平衡、促進泡沫細胞中膽固醇的外流以及具有抗氧化和消炎等作用，該基因缺陷將使體內(nèi)脂代謝發(fā)生紊亂。ApoE基因敲除的純合小鼠(ApoE-/-)可正常存活和繁殖，當給予適當?shù)母咧嬍硶r，可導致各種高脂蛋白血癥[1-3]，并且其斑塊分布與人類的動脈粥樣硬化斑塊的分布相似，在動脈粥樣硬化的研究中發(fā)揮重要作用。本文使用西方膳食飼料和標準飼料兩種不同脂肪和膽固醇含量的飼料喂養(yǎng)ApoE-/-基因敲除小鼠，探究其血生化指標和動脈病理學的改變，為后續(xù)該模型小鼠的使用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取約3月齡的SPF級載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)36只和C57BL/6J小鼠18只，其來源于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK(粵)2013-002]，動物飼養(yǎng)環(huán)境條件為20～26 ℃，相對濕度40%～70%。36只ApoE-/-小鼠分為6組，每組6只，分別為：喂養(yǎng)西方膳食(主要成分見表1)3個月(H6)、4個月(H7)和5個月(H8)組，和標準飼料(主要成分見表2)3個月(M6)、4個月(M7)和5個月(M8)組。西方膳食飼料含21%脂肪、0.25%膽固醇；標準飼料含10%脂肪。18只C57BL/6J小鼠即對照組小鼠(所喂飼料見表2)，共分3組，每組6只，分別為：6月齡(WT6)、7月齡(WT7)和8月齡(WT8)組，飼養(yǎng)期間自由飲水。

表1 西方膳食飼料主要組分及營養(yǎng)含量Table 1 Main components and nutrient contents of Western diet

表2 標準飼料及C57小鼠飼料主要組分及營養(yǎng)含量Table 2 Main components and nutrient contents of standard diet and C57 mice diet

1.2 主要試劑和儀器

試劑：溶血劑，DH-910，DH-680；清洗劑，DH-520，DH-620；稀釋液，DH-640(東湖儀器試劑有限公司)

儀器：輪轉切片機(德國LEICA公司 RM2135)，生物組織全自動脫水機(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 TS-12C)，生物組織包埋機及冷凍機(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 BM-VII)，攤片烤片機(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 CS-VI)，生物組織全自動染色機(湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司 RS-18)，正置光顯微鏡(Olympus BX41)，病理圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Expess 5.1.1.14)，血液分析儀(NIHONKOHDEN)等。

1.3 血脂測定

9組小鼠喂養(yǎng)到指定月齡后，稱體質(zhì)量并摘取眼球取血(不空腹)，離心，分離血清，使用NIHONKOHDEN血液分析儀測定各組小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.4 樣本取材及制備

動物處死后，取主動脈根部，4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸臘、包埋、切片(4 μm)、烤片，常規(guī)HE染色，封片。在光學顯微鏡下觀察主動脈弓有無動脈粥樣硬化病變，并用OLYMPUS BX41顯微鏡拍照。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 血脂水平的變化

與同月齡的對照組小鼠相比，高脂日糧喂養(yǎng)的H組與普通日糧喂養(yǎng)的M組的APOE基因敲除小鼠在TC和LDL-C兩方面顯著升高，并且H組顯著高于M組小鼠。在HDL-C方面，H6組與M6組小鼠顯著高于WT6組小鼠，并且H6組小鼠也顯著高于M6組小鼠；同樣H8組與M8組小鼠在HDL-C方面也顯著高于同WT8組小鼠，H8組小鼠也顯著高于M8組；在7月齡組，H7與M7組小鼠顯著高于WT7組小鼠，但是H7組與M7組小鼠相比并沒有顯著性差異。各組血漿TG沒顯著性差異，無統(tǒng)計學意義。

表3 6月齡各組小鼠血清血脂水平比較Table 3 Comparison of lipid levels in sera among the 6 months old mice

注：不同字母代表具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)

Note：Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

表4 7月齡各組小鼠血清血脂水平比較Table 4 Comparison of lipid levels in sera among the 7 months old mice

注：不同字母代表具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)

Note：Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

表5 8月齡各組小鼠血清血脂水平比較Table 5 Comparison of lipid levels in sera among the 8 months old mice

注：不同字母代表具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)

Different uppercase indicate significant statistical difference between at the significance level of 0.05

2.2 ApoE-/-小鼠主動脈弓AS病變的觀察

在高倍鏡下觀察，WT6組：6只動物主動脈弓鏡下均未見動脈粥樣硬化(見圖1 A)。M6組：4只動物(4/6)主動脈弓鏡下見動脈粥樣硬化，泡沫細胞聚集(見圖1B)。H6組：5只動物(5/6)主動脈弓鏡下均見動脈粥樣硬化(見圖1C)。

圖1 6月齡小鼠的HE染色情況注：A.WT6組主動脈弓未見病變；B.M6組主動脈弓部分出現(xiàn)動脈粥樣硬化；C.H6組大多數(shù)出現(xiàn)動脈粥樣硬化Fig.1 HE staining of 6 months old miceNote:A. no lesions of aortic arch in WT6 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M6 group; C. atherosclerosis occurred mostly in H6 group

WT7組：1只動物(1/6)可見動脈粥樣硬化，內(nèi)膜下纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見泡沫細胞及膽固醇結晶。其余動物主動脈弓未見明顯異常(見圖2A)。M7組：3只動物(3/6)可見動脈粥樣硬化，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)膜下纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見泡沫細胞及膽固醇結晶，其中1只動物(1/6)斑塊局部可見壞死鈣化灶。其余動物主動脈弓未見明顯異常(見圖2B)。H7組：6只動物(6/6)均可見動脈粥樣硬化，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)膜下纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見泡沫細胞，其中5只動物(5/6)斑塊內(nèi)可見膽固醇結晶(見圖2C)。

圖2 7月齡小鼠的HE染色情況注：A.WT7組主動脈弓未見病變；B.M7組主動脈弓部分出現(xiàn)動脈粥樣硬化；C.H7組全部出現(xiàn)動脈粥樣硬化Fig.2 HE staining of 7 months old miceNote：A. no lesions of aortic arch in WT7 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M7group; C. atherosclerosis occurred mostly in H7 group

WT8組：所有動物均未見動脈粥樣硬化(見圖3A)；M8組：4只小鼠(4/6)主動脈弓鏡下可見動脈粥樣硬化(見圖3B)；H8組：5只小鼠(5/6)主動脈弓鏡下可見動脈粥樣硬化(見圖3C)。

圖3 8月齡小鼠的HE染色情況注：A.WT8組主動脈弓未見病變；B.M8組主動脈弓部分出現(xiàn)動脈粥樣硬化；C.H8組大多數(shù)出現(xiàn)動脈粥樣硬化Fig.3 HE staining of 8 months old miceNote：A. no lesions of aortic arch in WT8 group；B. atherosclerosis in part of aortic arch in M8group; C. atherosclerosis occurred mostly in H8 group

3 討論

以往的AS動物模型多采用極高含量的膽固醇、脂肪的飼料長期飼養(yǎng)制作，但由于小鼠、大鼠等動物先天具有膽固醇抵抗的特性，在制作模型時，膽固醇負荷往往是正常膳食的數(shù)十倍的急性過程，因此與人類的病癥情況相差甚遠[4-6]。ApoE基因敲除小鼠是由美國洛克菲勒大學生化遺傳與代謝實驗室和北卡羅萊那大學病理遺傳實驗室于1992年應用胚胎干細胞基因敲除技術培育成功。有研究表明該小鼠用普通飼料喂養(yǎng)也可自發(fā)形成纖維斑塊和復合斑塊，高脂飼料喂養(yǎng)可以加速AS，并且動脈粥樣硬化斑塊分布與人類的相似[7]。田楓等[8]研究發(fā)現(xiàn)普通飼養(yǎng)的ApoE敲除小鼠12個月時，其主要血管仍呈現(xiàn)明顯的動脈粥樣特征，表明ApoE敲除小鼠是動脈粥樣硬化研究的可靠的動物模型。據(jù)報道ApoE敲除小鼠，15～20周齡后逐漸出現(xiàn)纖維斑塊，病變部位以主動脈根最為明顯，其次為胸主動脈。

本研究中我們采用的是21%脂肪、0.25%膽固醇的“西方膳食”飼料和標準飼料(中等脂肪含量)對ApoE-/-小鼠進行誘導，經(jīng)過3個月、4個月和5個月的誘導后發(fā)現(xiàn)，相同月齡下，在TC和LDL-C方面，西方膳食組和標準飼料組顯著高于對照組(WT組)，同時西方膳食組也顯著高于標準飼料組；在HDL-C方面，飼喂3個月與5個月表現(xiàn)出同樣的結果。但是在飼喂4個月時，西方膳食組和標準飼料組都顯著高于對照組(WT組)，兩組無顯著差異。在主動脈弓病理切片及染色方面，相同月齡下，西方膳食組主動脈斑塊明顯并且AS發(fā)病率明顯升高。該小鼠可為AS的多方面研究提供有效的實驗動物模型：藥物篩選、分子干預等；以及AS病理學機制的相關研究等。

本研究用含有21%脂肪和0.25%膽固醇的西方膳食飼料(高脂飼料)和10%脂肪的標準飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠，經(jīng)3個月、4個月及5個月的飲食處理后，西方膳食飼料喂養(yǎng)的小鼠血漿總膽固醇、高密度脂蛋白指標(H6和H8)、低密度脂蛋白指標比標準飼料及對照組組(WT組)明顯升高，同時標準飼料組也明顯高于對照組(WT組)；在主動脈弓病理切片及染色方面，西方膳食飼料組和標準飼料組都表現(xiàn)出血管內(nèi)膜纖維斑塊形成，斑塊內(nèi)可見泡沫細胞及膽固醇結晶的典型動脈粥樣硬化病理特征。表明：西方膳食飼料及標準飼料均可誘導ApoE-/-小鼠表現(xiàn)AS病癥，而且西方膳食飼料的誘導效果更明顯。本研究觀察動物經(jīng)西方膳食飼料和標準飼料喂養(yǎng)后的血脂情況及ApoE-/-主動脈弓的病變特點，為該模型在心血管疾病等老年病學研究的廣泛應用提供了基礎資料。