謝媚媚 潘敏 龔裕強(qiáng)

慢性腎臟病（CKD）是一種病因復(fù)雜的的進(jìn)行性疾病，是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要病因。腎間質(zhì)纖維化(RIF)是CKD進(jìn)展到慢性腎衰竭過程中腎臟組織發(fā)生的主要病理改變。miRNA是一類約18～24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼單鏈小分子RNA，可與靶基因配對(duì)引起其降解，或者抑制其翻譯，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-29c在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型腎組織中表達(dá)下調(diào)，可能參與RIF的發(fā)生、發(fā)展[2]。miRNA在血清中相對(duì)穩(wěn)定，且具有抗酸、抗堿、抗凍融處理、抗RNA酶的特性[3]，血液樣本容易獲取，這為研究miRNA在血清中的表達(dá)提供了可行性?；诖?，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-29c在CKD患者中的表達(dá)情況，分析其與RIF的關(guān)系，探討miR-29c作為診斷RIF的生物標(biāo)志物的可能性，并以期為臨床治療RIF提供新的靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2013年5月至2018年9月本院收治的CKD患者135例為CKD組，其中男71例，女64例；年齡 18～65（40.9±4.8）歲；BMI 18.5～25.8（21.9±2.4）；均符合K/DOQI指南中CKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，其中慢性腎小球腎炎78例，糖尿病腎病25例，高血壓腎病24例，多囊腎8例；均經(jīng)腎穿刺活檢明確有不同程度的RIF，所有患者均未開始行透析治療（包括血液透析和腹膜透析）；排除紅斑狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、乙肝相關(guān)性腎炎等繼發(fā)性病變以及遺傳性腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)病變，排除合并心肺疾病、腎功能突發(fā)進(jìn)行性惡化患者。另擇同期健康體檢無腎臟疾病者135例為正常對(duì)照組，其中男 70 例，女 65 例；年齡 19～64（41.2±5.1）歲；BMI 18.6～26.1（21.7±2.1）；均無糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)疾病。兩組受檢者性別、年齡、BMI等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 Trizol試劑購于美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I熒光定量試劑盒購于日本TOYOBO公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)并提供；低速臺(tái)式離心機(jī)購于上海安亭儀器廠；超低溫冰箱購于美國(guó)Thermo公司；PCR儀購于德國(guó)Eppendorf公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購于美國(guó)ABI公司。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 血清肌酐、胱抑素C水平檢測(cè) 抽取兩組受檢者清晨空腹靜脈血10ml，室溫下靜置1～2h，低速離心分離（室溫下3 000r/min離心10min），冰上取上清液，部分上清液分裝于EP管中，-80℃保存用于提取RNA，另一部分上清液用于檢測(cè)血清肌酐、胱抑素C。血清胱抑素C檢測(cè)采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，試劑盒由金華市強(qiáng)盛生物科技有限公司生產(chǎn)。血清胱抑素C、血肌酐使用西門子ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.2 腎臟病理學(xué)檢查 CKD組患者入院后均首次在B超引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎活檢穿刺術(shù)，取新鮮腎臟活檢標(biāo)本進(jìn)行Masson染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織病理圖片判斷RIF的嚴(yán)重程度。RIF指數(shù)評(píng)估方法：每例標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下（×200）隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)的腎皮質(zhì)區(qū)進(jìn)行拍照，采用IPP 6.0圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野小管間質(zhì)纖維化面積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比；0分，無損傷，≤5%；1分，輕度損傷，6%～25%；2分，中度損傷，26%～50%；3分，重度損傷，＞50%[5]。10個(gè)視野取平均分為RIF指數(shù)。

1.2.2.3 miR-29c、膠原Ⅰ（ColⅠ）mRNA水平檢測(cè) ColⅠ基因是miR-29c的靶基因之一，ColⅠ是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要組成成份。采用Trizol法提取兩組受檢者血清總RNA，按照勻漿、兩相分離、沉淀、清洗、溶解沉淀步驟進(jìn)行，提取的RNA置于-80℃超低溫冰箱中保存。用紫外分光光度法確定RNA濃度及鑒定純度。在普通PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。反應(yīng)體系20μl，包括總 RNA 3μg、Oligo（dT）18 2μl、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl、RNase inhibitor 1μl、dNTP 1μl、DEPC 水加至20μl。反應(yīng)條件：16℃ 30min，42℃ 30min，70℃ 15min，結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物于-20℃保存。使用SYBR Green法，反應(yīng)體系 20μl，其中前向引物 1.5μl、反向引物 1.5μl、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1μl、plus solution 2μl、SYBR GreenⅠMaster mix 10μl、雙蒸水加至 20μl。反應(yīng)條件為 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min（ColⅠmRNA 為 58 ℃ 1min），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，所有樣品均做3個(gè)復(fù)孔[2]。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)定量，miR-29c的內(nèi)參為U6，ColⅠmRNA的內(nèi)參為GAPDH，ΔΔCt=[Ct目的基因（CKD組）-Ct內(nèi)參（CKD組）] -[Ct目的基因（正常對(duì)照組）-Ct內(nèi)參（正常對(duì)照組）] ，正常對(duì)照組的ΔΔCt為0，因此以2-ΔΔCt表示CKD組相對(duì)于正常對(duì)照組的表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較兩組受檢者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表達(dá)水平；分析CKD組患者血清miR-29c表達(dá)水平與RIF指數(shù)、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者血清肌酐、胱抑素C水平及miR-29c、ColⅠmRNA表達(dá)水平比較 CKD組患者血清肌酐、胱抑素C水平均高于正常對(duì)照組（均P＜0.05），血清miR-29c表達(dá)水平低于正常對(duì)照組（P＜0.05），ColⅠmRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

2.2 CKD組患者血清miR-29c表達(dá)水平與RIF指數(shù)、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相關(guān)性分析CKD組患者RIF指數(shù)為（2.39±0.77）分。CKD組患者血清miR-29c表達(dá)水平與RIF指數(shù)、血清肌酐水平、血清胱抑素C水平、ColⅠmRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），見表 2。

表2 CKD組患者血清miR-29c表達(dá)水平與RIF指數(shù)、血清肌酐、血清胱抑素C、ColⅠmRNA相關(guān)性分析

3 討論

CKD已成為全球公共健康問題，成人CKD全球患病率約為10%～13%[6]。RIF是各種原因?qū)е碌腃KD進(jìn)展為終末期腎衰竭的共同途徑[7]，因ECM產(chǎn)生與降解失衡，導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)過度沉積，包括ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ和纖連蛋白等。miRNA參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化及炎癥、免疫反應(yīng)等生理病理過程[8]。miRNA與器官纖維化密切相關(guān)，miR-29c在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型腎組織中以及轉(zhuǎn)分化后的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可能參與RIF的發(fā)生、發(fā)展過程[2，9]。本研究CKD組患者均經(jīng)腎臟穿刺活檢明確有不同程度的RIF，與正常對(duì)照組相比，血清miR-29c表達(dá)明顯下調(diào)，提示miR-29c表達(dá)下調(diào)可能與RIF有關(guān)。

ColⅠ在人肝癌（HepG2）體外細(xì)胞株中證實(shí)是miR-29c的靶基因[1]。本研究結(jié)果顯示，CKD組患者血清miR-29c表達(dá)明顯下調(diào)，ColⅠmRNA表達(dá)明顯上升，兩者呈負(fù)相關(guān)，這說明miR-29c負(fù)向調(diào)控ColⅠ。miR-29c的靶基因包括 ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、ColⅤ、原纖維蛋白、層粘連蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A等[10-11]，大部分編碼ECM，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A促進(jìn)ECM在內(nèi)皮細(xì)胞外堆積。在CKD患者中，血清miR-29c表達(dá)明顯下調(diào)，可能通過以上靶基因使ECM生成增多并促進(jìn)ECM堆積而參與RIF，且miR-29c與RIF指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說明miR-29c可能是RIF發(fā)生、發(fā)展中的一個(gè)重要參與因子。

腎臟疾病的預(yù)后與RIF程度密切相關(guān)。腎臟穿刺活檢行病理學(xué)檢查能夠直接反應(yīng)腎組織的病理特點(diǎn)，目前仍是檢測(cè)RIF的主要手段。但腎臟穿刺活檢具有一定危險(xiǎn)性，術(shù)后存在出血、繼發(fā)感染等風(fēng)險(xiǎn)，且需重復(fù)活檢了解病情進(jìn)展以及評(píng)估治療效果。miRNA在血液循環(huán)、尿液或其他體液中能夠穩(wěn)定存在，不易降解，被認(rèn)為是最有潛力的疾病生物標(biāo)志物，可反映某些疾病病變及病情嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果表明CKD患者血清miR-29c表達(dá)水平隨著RIF的加重而下降，提示miR-29c的表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)RIF嚴(yán)重程度的指標(biāo)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清中miRNA表達(dá)水平已經(jīng)是一項(xiàng)成熟技術(shù)，因此，檢測(cè)CKD患者血清miR-29c表達(dá)水平可作為診斷RIF以及隨訪的檢查指標(biāo)。

血清肌酐是最常用來評(píng)價(jià)腎功能的指標(biāo)，血清胱抑素C作為內(nèi)源性標(biāo)志物，與腎小球?yàn)V過率相關(guān)性最好，其主要由腎小球?yàn)V過率決定，不受性別、肌肉容積、炎癥、腫瘤影響，是反映腎功能的敏感指標(biāo)[12]。本研究中CKD組患者血清miR-29c表達(dá)水平與血清肌酐、血清胱抑素C水平均呈負(fù)相關(guān)，提示miR-29c的表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)腎功能的輔助指標(biāo)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，將人工合成的miR-29c mimics轉(zhuǎn)染大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞上調(diào)miR-29c，可抑制ColⅠ表達(dá)起到抗纖維化作用[9]。本研究在CKD患者中證實(shí)miR-29c負(fù)向調(diào)控ColⅠ，這為今后治療RIF提供了新的方向。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CKD患者血清miR-29c表達(dá)明顯下調(diào)，miR-29c可能通過相應(yīng)靶基因使ECM生成增多，并促進(jìn)ECM堆積而參與RIF。血清miR-29c表達(dá)水平可作為診斷RIF以及隨訪的生物標(biāo)志物，且可作為評(píng)價(jià)腎功能的輔助指標(biāo)，其抗纖維化作用為臨床治療RIF提供了新的方向。