高倩 章文俊 楊國(guó)軍 潘曄 陳乃君 朱巍 金華偉

糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今未完全闡明。胰島素作為人體內(nèi)最主要的降糖激素，由胰島β細(xì)胞合成和分泌。目前研究認(rèn)為，胰島β細(xì)胞去分化在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，然而其去分化的機(jī)制尚不明確。Talchai等[1]研究發(fā)現(xiàn)，敲除FoxO1基因的小鼠在代謝壓力（多產(chǎn)、高齡）下分化成熟的胰島β細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)化成一種表達(dá)神經(jīng)元素3、八聚體轉(zhuǎn)錄因子4（Oct4）的前體細(xì)胞，小鼠最終患上糖尿病。劉嬋等[2]則發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞在高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)下會(huì)發(fā)生去分化，并發(fā)現(xiàn)磷酸化的FoxO1表達(dá)改變。本研究通過(guò)觀察高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)的小鼠胰島β細(xì)胞磷酸化FoxO1（p-FoxO1）、FoxO1 蛋白和 mRNA、前 β 細(xì)胞標(biāo)志物Oct4蛋白以及β細(xì)胞標(biāo)志物胰腺十二指腸同源盒-1（PDX1）蛋白表達(dá)水平變化，并于FoxO1磷酸化酶抑制劑渥曼青霉素干預(yù)后觀察其對(duì)β細(xì)胞去分化的影響，探討FoxO1在高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠胰島β細(xì)胞去分化中的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠胰島β細(xì)胞MIN-6細(xì)胞由中南大學(xué)細(xì)胞室提供，HTCC編號(hào)：9號(hào)。渥曼青霉素為中國(guó)solarbio公司產(chǎn)品（批號(hào)：200706）。DMEM培養(yǎng)液為美國(guó)HyClone公司產(chǎn)品，F(xiàn)BS為澳大利亞BOVOGEN公司產(chǎn)品。p-FoxO1（位點(diǎn)：256、319）一抗、FoxO1、Oct4 和PDX1一抗為美國(guó)bioworld公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記二抗為美國(guó)jackson公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR037A）和SYBR Premix Ex TapTM（RR420）購(gòu)于日本 TaKaRa公司。Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 MIN-6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%FBS、葡萄糖濃度25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，2～3d換液1次。細(xì)胞分組如下：常規(guī)糖濃度組（葡萄糖濃度25mmol/L，RG組）、高張濃度組（葡萄糖濃度25mmol/L+甘露醇35mmol/L，RG+M組）、高糖濃度組（葡萄糖濃度 60mmol/L，HG組）、高糖濃度+渥曼青霉素干預(yù)組（葡萄糖濃度60mmol/L+渥曼青霉素 50nmol/L，HG+W組）。

1.2.2 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1、Oct4、PDX1蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。MIN-6細(xì)胞分組培養(yǎng)后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。變性后取40μg總蛋白上樣，SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1、Oct4、PDX1、β-actin 一抗孵育過(guò)夜；洗膜后分別加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，再次洗膜后予ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Molecular Imager ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光掃描并用Imagelab軟件分析結(jié)果，以所測(cè)得的各條帶的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值作為蛋白表達(dá)的半定量值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 FoxO1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green熒光染料定量PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0軟件包。引物的特異性比對(duì)采用NCBI的Primer BLAST。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用20μl體系，SYBR熒光染料 10μl、上下游Primer各 0.5μl、DEPC 水 8μl、cDNA 1μl。以 β-actin 為內(nèi)參，各引物序列如下：（1）FoxO1上游引物 5′-GAGCGTGCCCTACTTCAA-3′，下游引物 5′-CCATCTCCCAGGTCATCC-3′;（2）β-actin上游引物5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游引物 5′-ATGTCACGCAGATTTCC-3′。用SYBR Green染料熒光定量PCR分析，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性30s；隨后 95℃ 5s，60℃20s，40 個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量 2-ΔΔCT法計(jì)算 mRNA 表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較：（1）不同培養(yǎng)時(shí)間（培養(yǎng)0、12、24、48h）HG 組 MIN-6 細(xì)胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1 蛋白表達(dá)水平；（2）不同培養(yǎng)時(shí)間（培養(yǎng) 0、12、24、48、72h）HG 組 MIN-6 細(xì)胞 FoxO1 mRNA 表達(dá)水平；（3）培養(yǎng) 12h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W組 MIN-6 細(xì)胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達(dá)水平，及培養(yǎng)72h時(shí)4組MIN-6細(xì)胞Oct4、PDX1蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間HG組MIN-6細(xì)胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間HG組MIN-6細(xì)胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達(dá)電泳圖

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間HG組MIN-6細(xì)胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達(dá)水平比較（與0h比較，*P＜0.05）

由圖1、2可見(jiàn)，HG組MIN-6細(xì)胞高糖培養(yǎng)0、12、24、48h 時(shí) p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而FoxO1蛋白表達(dá)水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。高糖培養(yǎng)12、24、48h 時(shí) MIN-6 細(xì)胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）表達(dá)水平均明顯高于0h（均P＜0.05），提示在一定時(shí)間范圍內(nèi)，高糖可以刺激MIN-6細(xì)胞FoxO1信號(hào)分子256及319位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間HG組MIN-6細(xì)胞FoxO1 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖3。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間HG組MIN-6細(xì)胞FoxO1 mRNA表達(dá)水平比較

由圖3可見(jiàn)，HG組MIN-6細(xì)胞高糖培養(yǎng)0、12、24、48、72h時(shí)FoxO1 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 培養(yǎng) 12h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細(xì)胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1 蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖4、5。

圖4 培養(yǎng)12h時(shí)RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細(xì)胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1 蛋白表達(dá)電泳圖

圖5 培養(yǎng)12h時(shí)RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細(xì)胞p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）、FoxO1蛋白表達(dá)水平比較（與RG組比較，*P＜0.05；與 HG 組比較，△P＜0.05）

由圖 4、5可見(jiàn)，培養(yǎng) 12h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6 細(xì)胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而FoxO1蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與RG 組比較，HG 組 MIN-6 細(xì)胞 p-FoxO1（256）、p-Fox－O1（319）蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01），而 RG+M 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與HG組比較，RG+M組MIN-6 細(xì)胞 p-FoxO1（256）、p-FoxO1（319）蛋白表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05）。

2.4 培養(yǎng) 72h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細(xì)胞Oct4蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖6、7。

圖6 培養(yǎng)72h時(shí)RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細(xì)胞 Oct4蛋白表達(dá)電泳圖

圖7 培養(yǎng)72h時(shí)RG、RG+M、HG、HG+W 組MIN-6細(xì)胞 Oct4蛋白表達(dá)水平比較（與RG組比較，*P＜0.05；與HG組比較，△P＜0.05）

由圖 6、7可見(jiàn)，培養(yǎng) 72h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細(xì)胞Oct4蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與RG組比較，HG組MIN-6細(xì)胞Oct4蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），RG+M組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與HG組比較，RG+M組MIN-6細(xì)胞Oct4蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

2.5 培養(yǎng) 72h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細(xì)胞PDX1蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖8、9。

由圖 8、9可見(jiàn)，培養(yǎng) 72h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細(xì)胞PDX1蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與RG組比較，HG+W組MIN-6細(xì)胞PDX1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），RG+M組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與HG組比較，HG+W組MIN-6細(xì)胞PDX1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。

圖 8 培養(yǎng) 72h時(shí) RG、RG+M、HG、HG+W 組 MIN-6細(xì)胞 PDX1蛋白表達(dá)電泳圖

圖9 培養(yǎng)72h時(shí)RG、RG+M、HG、HG+W組MIN-6細(xì)胞PDX1蛋白表達(dá)水平比較（與RG組比較，*P＜0.05；與HG組比較，△P＜0.05）

3 討論

近30年來(lái)，我國(guó)糖尿病的發(fā)病率逐年上升，已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大疾病，2007年流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，我國(guó)20歲以上成年人糖尿病患病率為9.7%，中國(guó)成人糖尿病總數(shù)達(dá)9 240萬(wàn)。2010年中國(guó)國(guó)家疾病預(yù)防控制中心調(diào)查顯示我國(guó)糖尿病患病率為9.7%，再次證實(shí)我國(guó)可能已成為世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國(guó)家[3]。糖尿病是一組以高血糖為主要特征的臨床綜合征。高血糖的產(chǎn)生主要是由胰島β細(xì)胞功能缺陷，引起胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足，以及周圍胰島素敏感組織對(duì)胰島素抵抗引起。過(guò)去一直認(rèn)為胰島β細(xì)胞凋亡是β細(xì)胞缺陷的主要形式，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞去分化比例高達(dá)31.9%（非糖尿病患者為8.7%）[4]，在2型糖尿病動(dòng)物模型的胰島中觀察到大量胰島素表達(dá)陰性的細(xì)胞，該類細(xì)胞能表達(dá)嗜鉻粒蛋白-A、neurogenin3、Oct4等前β細(xì)胞標(biāo)志物，并觀察到了FoxO1的進(jìn)行性丟失[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)下，MIN6細(xì)胞去分化為表達(dá)Oct4的前β細(xì)胞，β細(xì)胞標(biāo)志物PDX1表達(dá)水平降低。

FoxO1是Forkhead蛋白大家族的一個(gè)亞群，主要表達(dá)在胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，是一種多功能蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、分化、應(yīng)激、自噬、代謝。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1可抑制胰島α細(xì)胞向β細(xì)胞轉(zhuǎn)化、保護(hù)β細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷、維持β細(xì)胞終末分化狀態(tài)以及抑制胰腺祖細(xì)胞分化為β細(xì)胞[6-9]。FoxO1的活性主要受磷酸化/去磷酸化水平調(diào)節(jié)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)下，MIN6細(xì)胞中FoxO1 mRNA、蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但其256及319位點(diǎn)出現(xiàn)磷酸化，通過(guò)FoxO1磷酸化酶抑制劑渥曼青霉素抑制FoxO1的磷酸化，去分化的細(xì)胞再次分化為表達(dá)PDX1的β細(xì)胞。這說(shuō)明FoxO1通過(guò)磷酸化與去磷酸化的轉(zhuǎn)換在β細(xì)胞去分化中發(fā)揮作用。

FoxO1有多個(gè)蘇氨酸和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別為N端的1個(gè)蘇氨酸和中部的2個(gè)絲氨酸位點(diǎn)。無(wú)刺激因子時(shí)，F(xiàn)oxO1以去磷酸化狀態(tài)位于細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)受刺激后，F(xiàn)oxO1發(fā)生磷酸化而由核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。FoxO1在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)穿梭，與14-3-3蛋白密切相關(guān)。14-3-3蛋白主要存在細(xì)胞核內(nèi)，可以識(shí)別絲氨酸和蘇氨酸殘基。FoxO1磷酸化后，構(gòu)象發(fā)生改變，與14-3-3蛋白結(jié)合，介導(dǎo)了FoxO1的核輸出[11-13]。Ser256是核定位關(guān)鍵位點(diǎn)，它的磷酸化與FoxO1的核輸出密切相關(guān)，Ser319則影響FoxO1的核輸出效率[14]。伴隨著FoxO1的磷酸化和去磷酸化、與DNA的解離和結(jié)合，可以關(guān)閉或啟動(dòng)某些基因的表達(dá)而產(chǎn)生不同的生理反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)FoxO1 256和319位點(diǎn)磷酸化參與了高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞去分化，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，高糖可能通過(guò)FoxO1 256和319位點(diǎn)磷酸化而參與誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠胰島β細(xì)胞發(fā)生去分化。