葉武 欽光躍 唐婷玉 杜堅(jiān)宗 劉娟 黎雪芳

肺腺癌是肺癌常見的組織學(xué)類型。肺腺癌患者Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）突變的檢出率接近30%[1]，然而目前尚無直接靶向KRAS突變的有效藥物[2-3]。因此，臨床迫切需要研究針對(duì)KRAS突變的治療方案。蓽茇酰胺屬于生物堿類化合物，最初分離自胡椒科植物蓽茇Piper longum Linn.的根，具有多種藥理學(xué)作用，是一種極具潛力的中藥單體[4]。2011年，Raj等[5]研究發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺可選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞而不影響正常組織?；诖?，本研究旨在探討蓽茇酰胺對(duì)KRAS突變肺腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺腺癌KRAS突變細(xì)胞株A549購自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。蓽茇酰胺為美國(guó)Selleck chemicals公司產(chǎn)品。無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基RPMI 1640購自杭州基諾生物工程有限公司。CCK-8溶液購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）染色液和碘化丙啶（PI）染色液為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（BCL2）抗體均為美國(guó)CST公司產(chǎn)品，微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（LC3B）抗體為美國(guó)Novus Biologicals公司產(chǎn)品，α-tubulin抗體為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀購自日本富士膠片公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞在含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法。A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收集細(xì)胞，吸取適量體積的細(xì)胞懸液加入96孔板中（接種細(xì)胞數(shù)3 000個(gè)/孔），置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h 后加入不同濃度梯度（0、1、5、8、10μmol/L）的蓽茇酰胺，繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入10μl CCK-8溶液，采用超微量分光光度計(jì)，測(cè)定在450nm處吸光度（OD值）。細(xì)胞活力（%）=[OD值（加藥）-OD值（空白）] /[OD值（未加藥）-OD值（空白）] ×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 收集5～10萬個(gè)A549細(xì)胞，1 000r/min 離心 5min，棄上清液，用 100μl的 1×Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀的檢測(cè)管。加入5μl Annexin V-FITC染色液和5μl PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=Annexin V-FITC陽性PI陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。使用蛋白提取試劑提取A549 細(xì)胞的總蛋白，采用 4，4′二羧酸-2，2′-喹啉（BCA）法進(jìn)行蛋白定量。取各樣本30～60μg蛋白質(zhì)，變性后上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳（具體根據(jù)所檢測(cè)的蛋白分子量，調(diào)節(jié)電泳時(shí)間），切取合適大小的膠，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫下封閉2h，加入細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP、BCL2，自噬相關(guān)蛋白LC3B以及α-tubulin一抗，4℃孵育過夜。取出PVDF膜，漂洗3次，加入二抗封閉液，室溫下孵育1.5h，滴加適量電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液，置入化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀曝光，采用Image J軟件計(jì)算Western blot蛋白條帶的灰度值，蛋白表達(dá)水平用相對(duì)灰度值表示，計(jì)算公式為：目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 0、1、5、8、10μmol/L 的蓽茇酰胺干預(yù) A549 細(xì)胞后，細(xì)胞活力分別是 100%、（92.312±2.923）%、（62.034±3.712）%、（45.731±5.215）%、（22.021±8.533）%（P＜0.05），蓽茇酰胺濃度越高，細(xì)胞活力越低（兩兩比較均P＜0.05）（圖1），這說明蓽茇酰胺可抑制KRAS突變肺腺癌細(xì)胞增殖。

圖1 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

2.2 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響0、1、5、10μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別是（9.624±1.812）%、（14.945±0.321）%，（16.834±1.515）%、（27.416±5.741）%（P＜0.05），蓽茇酰胺濃度越高，細(xì)胞凋亡率越高（兩兩比較均 P＜0.05）（圖 2、3）。這說明蓽茇酰胺可促進(jìn)KRAS突變肺腺癌細(xì)胞凋亡。

圖2 不同濃度蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

2.3 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP、BCL2 表達(dá)水平的影響 0、1、5、10μmol/L 蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白PARP、BCL2表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中10μmol/L蓽茇酰胺對(duì)PARP、BCL2表達(dá)水平的影響最明顯（均P＜0.05），可上調(diào)細(xì)胞PARP表達(dá)水平，下調(diào)BCL2表達(dá)水平（圖 4、表 1）。

圖3 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

圖4 不同濃度蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白PARP、BCL2表達(dá)電泳圖

表1 不同濃度蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白PARP、BCL2表達(dá)水平比較

2.4 不同濃度蓽茇酰胺對(duì)A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B表達(dá)水平的影響 0、1、5、10μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白LC3B表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中10μmol/L蓽茇酰胺對(duì)LC3B表達(dá)水平的影響最明顯（均P＜0.05），可上調(diào)細(xì)胞LC3BⅡ表達(dá)水平（圖5、表2）。

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類生命與健康。促癌基因鼠肉瘤病毒癌基因(RAS)是非小細(xì)胞肺癌患者常見的突變基因，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤癌基因（NRAS）、Harvery鼠肉瘤病毒癌基因（HRAS）和KRAS這3種[6]。在肺腺癌患者中，KRAS突變大約占RAS突變的90%[6-7]。但臨床目前尚無針對(duì)KRAS突變的有效靶向藥物。

圖5 不同濃度蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白LC3B表達(dá)電泳圖

表2 不同濃度蓽茇酰胺干預(yù)A549細(xì)胞后自噬相關(guān)蛋白LC3B表達(dá)水平比較

蓽茇酰胺具有多種藥理作用，參與調(diào)節(jié)原癌基因、轉(zhuǎn)錄因子、活性氧、激酶、蛋白酶體和炎癥因子等表達(dá)，在癌癥、高脂血癥、關(guān)節(jié)炎和狼瘡性腎炎等多種疾病中發(fā)揮作用[8]。本研究采用不同濃度的蓽茇酰胺干預(yù)KRAS突變肺腺癌細(xì)胞A549，發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺可明顯抑制細(xì)胞增殖，提示蓽茇酰胺或是治療KRAS突變肺腺癌的有效藥物。

細(xì)胞凋亡是多種藥物抗腫瘤作用的主要機(jī)制之一[9]。本研究結(jié)果顯示，蓽茇酰胺處理KRAS突變肺腺癌細(xì)胞A549后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，PARP表達(dá)上調(diào)，BCL2表達(dá)下調(diào)。Raj等[5]研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺可增加人膀胱癌p53細(xì)胞上調(diào)凋亡調(diào)控因子（PUMA）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑1A和caspase-3的表達(dá)，為蓽茇酰胺誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供了證據(jù)。

細(xì)胞自噬廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，是一種溶酶體依賴性的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)降解途徑。自噬相關(guān)蛋白LC3B在自噬過程中扮演重要角色，其被合成后立刻被剪切成LC3BⅠ。自噬被激活后，LC3BⅠ被修飾形成膜結(jié)合形的LC3BⅡ，后者被募集至自噬小體的雙層膜上。自噬小體形成是自噬過程中重要環(huán)節(jié)之一，因此LC3B常被作為監(jiān)測(cè)自噬發(fā)生的特異性標(biāo)志蛋白[10-11]。本研究結(jié)果顯示，蓽茇酰胺干預(yù)KRAS突變肺腺癌細(xì)胞A549后，LC3BⅡ表達(dá)水平明顯上調(diào)。這提示蓽茇酰胺參與調(diào)節(jié)KRAS突變肺腺癌的細(xì)胞自噬。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，蓽茇酰胺可抑制KRAS突變肺腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。蓽茇酰胺或可成為治療KRAS突變肺腺癌的新靶向藥物。