楊寓迪， 劉 琳， 王偉佳， 王冬雪， 張健松 ， 趙 瑛

腦卒中是嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人健康的疾病，其致死率在所有疾病中居第三位[1]。腦卒中指由腦部血管破裂及阻塞引起血液循環(huán)障礙所導(dǎo)致的疾病，其中頸動脈狹窄或閉塞是20%～30%腦卒中患者的主要誘發(fā)因素[2]。其中缺血性卒中具有較高的致殘率[3]，腦卒中后腦血流量呈低灌注或血流減少等，會導(dǎo)致氧和能量供應(yīng)中斷，神經(jīng)細(xì)胞死亡并引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[4]。隨著腦缺血情況的不斷加劇，由此引發(fā)的血管性癡呆已成為腦卒中困擾社會和家庭的主要并發(fā)癥之一[5]。

近年來體育運(yùn)動逐漸成為青年人和老年人追捧的生活方式之一。有大量的研究報(bào)道指出適宜的運(yùn)動能夠延緩心腦血管疾病的發(fā)生[6]。研究顯示適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動可以提高高血壓、超重、高膽固醇血癥和糖尿病患者的生存率[7]，降低認(rèn)知障礙發(fā)生的風(fēng)險[8]，對心血管疾病的預(yù)防作用顯著[9]。但也有許多人一味追求運(yùn)動的時間和運(yùn)動的強(qiáng)度，一旦運(yùn)動強(qiáng)度超過人體負(fù)荷則表現(xiàn)為過度運(yùn)動或疲勞運(yùn)動。有研究表明，過度運(yùn)動或疲勞運(yùn)動可能會導(dǎo)致海馬出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、深染，線粒體損傷以及海馬中腦腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的下調(diào)，海馬功能受損，引起記憶能力下降等問題[10]。

本文采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法建立大鼠腦缺血模型，并于腦缺血前進(jìn)行大鼠疲勞運(yùn)動訓(xùn)練。采用雙通道激光多普勒腦血流儀對其腦血流量進(jìn)行測定，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對大鼠的學(xué)習(xí)記憶情況進(jìn)行測定，分別觀察疲勞運(yùn)動對正常及腦缺血大鼠腦血流量和學(xué)習(xí)記憶功能的變化情況。為疲勞運(yùn)動對腦卒中后的病程影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF級成年健康雄性Wistar大鼠120只，體重為180～240 g。由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證編號：201700018990。實(shí)驗(yàn)動物采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、攝食。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，根據(jù)體重分層隨機(jī)分為4組：陰性對照組(SO，n=20)，疲勞運(yùn)動組(OE，n=20)，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎組(2-VO，n=40)，雙側(cè)頸總動脈并疲勞運(yùn)動組(OE+2-VO，n=40)，訓(xùn)練2 w后對2-VO組及2-VO+OE組進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎，建立模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 疲勞運(yùn)動模型的建立 動物跑臺是依鼠跑步運(yùn)動而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)裝置，運(yùn)動強(qiáng)度可通過調(diào)整跑步的時間、跑步速度以及跑臺的坡度來控制，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后開始訓(xùn)練，采用遞增強(qiáng)度跑臺運(yùn)動，坡度為15°，將大鼠放置在跑道后，初始速度為5 m/min，逐漸加速，直到增速至30 m/min，跑至力竭，以120 min為期限，1次/d，訓(xùn)練14 d，記錄大鼠完成訓(xùn)練的情況，建立疲勞運(yùn)動模型[11]。SO組和2-VO組僅將大鼠置于跑臺上但不轉(zhuǎn)動跑臺。

1.2.2 腦缺血模型的建立 疲勞運(yùn)動后對2-VO組及2-VO+OE組采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2-VO)的方法建立腦缺血大鼠模型。手術(shù)組大鼠術(shù)前12 h禁食、4 h禁水。用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，分離暴露左、右側(cè)頸總動脈，套以“0”號絲線雙重結(jié)扎，逐層縫合，SO組及OE組大鼠除不結(jié)扎頸總動脈，其余同手術(shù)組。術(shù)后每天肌肉注射青霉素[12]。

1.2.3 大鼠額葉皮質(zhì)腦血流量的測定 腦血流量實(shí)驗(yàn)前的預(yù)處理：實(shí)驗(yàn)前1 w，所有大鼠麻醉后俯臥，放置于腦立體定位儀上，固定頭部，采取平顱固定法進(jìn)行大鼠頭顱的立體定位。之后頭部剃毛，剪開頭部皮膚2 cm，用過氧化氫擦拭清除軟組織，暴露出顱骨。參照Paxions-Watson大鼠腦立體定位圖譜(第6版)[13]，確定額葉(FrA)位置(中心點(diǎn)為前囟前5 mm，矢狀縫右側(cè)旁開2 mm)，為后期正式實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

分別于疲勞運(yùn)動訓(xùn)練或雙側(cè)頸動脈結(jié)扎14 d后，采用moorVMS雙通道激光多普勒腦血流儀進(jìn)行腦血流量的測定[14]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉20 min后，將多普勒光纖探頭固定至額葉處，記錄腦血流量、紅細(xì)胞聚集度、紅細(xì)胞運(yùn)動速度、回光強(qiáng)度等，測試時間為10 min。腦血流量的單位采用的是血流灌注單位PU，紅細(xì)胞聚集度、紅細(xì)胞運(yùn)動速度、回光強(qiáng)度的單位為AU。

1.2.4 學(xué)習(xí)記憶能力的測定 腦血流測定28 d后進(jìn)行Morris水迷宮測試[15]：實(shí)驗(yàn)前分別在水池四個方向貼上不同標(biāo)記物，分別為三角形，正方形，圓形和五角星紙片。放入平臺，使平臺低于水面2 cm，控制水溫在(20.0±2.0)℃。實(shí)驗(yàn)開始前移除平臺，將大鼠放入池內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，避免有刺激對大鼠造成應(yīng)激反應(yīng)。

定位航行實(shí)驗(yàn)：每天相同時間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將大鼠隨機(jī)從不同象限(除目標(biāo)象限)面壁置入池內(nèi)，記錄120 s內(nèi)尋找平臺的時間即逃避潛伏期，逃避潛伏期下降表示學(xué)習(xí)記憶增強(qiáng)。如果大鼠在120 s內(nèi)找到平臺，記錄120 s內(nèi)實(shí)際逃避潛伏期；如果在120 s 內(nèi)未找到平臺，由實(shí)驗(yàn)者將其引上平臺并停留30 s，以熟悉環(huán)境，逃避潛伏期記錄為120 s。大鼠每天訓(xùn)練2次[16]，連續(xù)訓(xùn)練5 d，然后進(jìn)行定位航行測試。

空間探索實(shí)驗(yàn)：將平臺移除，記錄大鼠穿越平臺次數(shù)。每次訓(xùn)練完成后將小鼠取出擦干，以防止低體溫造成的應(yīng)激。測試過程中保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，排除干擾因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

可視平臺實(shí)驗(yàn)：將水迷宮內(nèi)水排出部分，使水面低于平臺1～2 cm，在平臺處放置一個小旗，其余同定位航行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 疲勞運(yùn)動時期大鼠運(yùn)動完成情況結(jié)果 大鼠疲勞運(yùn)動完成百分率見圖1，在訓(xùn)練最初的7 d時間內(nèi)，絕大多數(shù)大鼠不能在120 min內(nèi)完成訓(xùn)練，表明這種強(qiáng)度對大鼠來說屬于疲勞運(yùn)動。隨著訓(xùn)練周期的延長，部分大鼠均能順利完成，訓(xùn)練10 d以后除有個別大鼠因身體素質(zhì)原因不能完成外，其它大鼠能夠完成120 min的訓(xùn)練。

圖1 完成訓(xùn)練大鼠的百分率(%)

2.2 腦血流量及其相關(guān)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 運(yùn)動2 w后，與SO組相比，OE組腦血流量顯著升高(P<0.05)，2-VO組血流量顯著降低(P<0.01)，與2-VO組比較，OE+2-VO組腦血流量顯著降低(P<0.01)。結(jié)果提示，腦缺血后大鼠腦血流量顯著下降，但疲勞運(yùn)動后的腦缺血大鼠腦血流量下降更為明顯，即使疲勞運(yùn)動會使腦血流量有小幅度回升，這種情況也不能緩解。這種腦血流量的大幅度下降提示疲勞運(yùn)動可能使得腦血流的損傷加劇。與2-VO組比較，OE+2-VO組紅細(xì)胞運(yùn)動速度顯著降低(P<0.01)，結(jié)果提示疲勞運(yùn)動合并腦缺血后腦血流量的顯著下降可能與紅細(xì)胞運(yùn)動速度下降有關(guān)。與OE組比較，OE+2-VO組紅細(xì)胞聚集度顯著下降(P<0.05)?；毓鈴?qiáng)度是反向散射光強(qiáng)度的指標(biāo)，受屋內(nèi)光強(qiáng)度的影響，可以實(shí)時監(jiān)測探頭的狀況，與腦血流量成反比例，固保持回光強(qiáng)度一致，使腦血流量不受光強(qiáng)的影響，在本實(shí)驗(yàn)中回光強(qiáng)度各組大鼠之間無顯著差異(P>0.05)，所測得的腦血流量值較為準(zhǔn)確(見表1)。

表1 血流量及相關(guān)參數(shù)測定結(jié)果

與SO組相比*P<0.05有顯著性差異**P<0.01有非常顯著性差異；與OE組相比▲P<0.05有顯著性差異▲▲P<0.01有非常顯著性差異；與2-VO組相比，●P<0.05有顯著性差異●●P<0.01有非常顯著性差異

2.3 Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶測試結(jié)果 模型建立后42 d后，對各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測試(見表2)，與SO組相比，OE組逃避潛伏期和穿臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05)，2-VO組和OE+2-VO逃避潛伏期顯著增加，穿臺次數(shù)顯著降低(P<0.05)，與2-VO組相比，OE+2-VO組逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)。說明運(yùn)動對大鼠的學(xué)習(xí)記憶并無明顯的影響，但腦缺血42 d后動物的學(xué)習(xí)記憶能力會顯著下降，運(yùn)動后腦缺血的動物學(xué)習(xí)記憶障礙更為明顯。平均速度結(jié)果顯示各組大鼠的平均速度無明顯變化(P>0.05)，排除了由于動物自身的因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響。

表2 各組大鼠Morris 水迷宮測試期結(jié)果

與SO組相比*P<0.05有顯著性差異**P<0.01有非常顯著性差異；與OE組相比▲P<0.05有顯著性差異▲▲P<0.01有非常顯著性差異；與2-VO組相比●P<0.05有顯著性差異●●P<0.01有非常顯著性差異

3 討 論

目前大多數(shù)文獻(xiàn)關(guān)于建立過度運(yùn)動或疲勞運(yùn)動的模型采取的方式主要有兩種：強(qiáng)迫游泳及跑臺訓(xùn)練[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，因后期要采用Morris水迷宮對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測試，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)可能會對其造成干擾，且腦血流前對大鼠的頭部要進(jìn)行預(yù)處理，為了防止傷口感染，故而本實(shí)驗(yàn)采用動物跑臺建立疲勞運(yùn)動模型。在訓(xùn)練最初的7 d時間內(nèi)，絕大多數(shù)大鼠不能在120 min內(nèi)完成訓(xùn)練，表明這種強(qiáng)度對大鼠來說屬于疲勞運(yùn)動。但隨著大鼠適應(yīng)能力的不斷加強(qiáng)，10～14 d絕大多數(shù)大鼠均可完成訓(xùn)練，因此將疲勞運(yùn)動訓(xùn)練時間定為14 d。這種做法既能減少大鼠的死亡率，又符合大鼠疲勞運(yùn)動病理過程。SO組和2-VO組僅將大鼠置于跑臺上但不轉(zhuǎn)動跑臺，排除應(yīng)激反應(yīng)可能造成的影響。

腦血流的主要功能是運(yùn)輸物質(zhì)和氧氣，以及帶走廢物和過多的熱量，腦血流量的變化是很多腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)之一[18]。研究結(jié)果顯示疲勞運(yùn)動合并腦缺血后可造成腦血流量的顯著下降，且這種下降程度要大于單純結(jié)扎造成的腦血流的下降。提示疲勞運(yùn)動合并腦缺血可能造成更為嚴(yán)重的腦損害，這種下降可能與紅細(xì)胞運(yùn)動速度下降有關(guān)，與紅細(xì)胞聚集濃度無關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)腦部血流量供應(yīng)不足會導(dǎo)致白質(zhì)疏松，以白質(zhì)的退行性改變?yōu)橹饕攸c(diǎn)[19]，從而導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能損傷、學(xué)習(xí)記憶功能障礙等，且在腦缺血42 d為損傷關(guān)鍵點(diǎn)[15]。因此本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮測定大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，評價疲勞運(yùn)動對大鼠腦缺血后行為功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎42 d后大鼠會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[15]。額葉皮質(zhì)與注意力、短時記憶任務(wù)、推理感等高級心理活動有關(guān)，在非任務(wù)的長期記憶保持中也起著非常重要的作用。額葉皮質(zhì)缺血會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙[20]。這一點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能與額葉皮質(zhì)腦血流量呈現(xiàn)一定的正相關(guān)。經(jīng)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后的大鼠會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙，而在結(jié)扎之前進(jìn)行疲勞運(yùn)動訓(xùn)練的大鼠腦血流量下降幅度更大，其出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙的程度也較單純的結(jié)扎頸總動脈要深，可能因?yàn)檫\(yùn)動的強(qiáng)度過大導(dǎo)致了大鼠海馬細(xì)胞的凋亡增加，從而加重了學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生[9]。

適度運(yùn)動能夠強(qiáng)身健體，改善自身的血液循環(huán)，但對于剛開始鍛煉的人來說，要結(jié)合自身的條件進(jìn)行運(yùn)動，近來，運(yùn)動過程中猝死的事件也屢見不鮮，“暴走”作為運(yùn)動中的一項(xiàng)，也曾經(jīng)引起過熱議，對于不常運(yùn)動的人來說，不少人在此之前并未參加過規(guī)律性的體育鍛煉，就進(jìn)行10～20千米以上的運(yùn)動，除了對機(jī)體運(yùn)動系統(tǒng)產(chǎn)生損傷外，還會加大神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡的風(fēng)險，若是患有認(rèn)知障礙疾病后，其發(fā)展成癡呆的速度也會較快，故應(yīng)該結(jié)合自身的條件，選擇適宜自己的運(yùn)動，在運(yùn)動期間也應(yīng)該循序漸進(jìn)，避免過度的疲勞運(yùn)動對機(jī)體造成的損傷。