張 勇， 宋 贊， 孫曉倩， 張 軒， 薛 蓉， 吳 偉

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由于環(huán)境或自身的生理、心理原因所導(dǎo)致的正常睡眠部分或全部喪失的過程和狀態(tài)。目前應(yīng)用最多動物睡眠剝奪模型的則是改良多平臺水環(huán)境法[1](modified multiple platform method，MMPM)。睡眠剝奪可引起情感、認(rèn)知等多種功能障礙，海馬是認(rèn)知記憶功能維持的重要結(jié)構(gòu)，但睡眠剝奪后海馬中細(xì)胞因子的動態(tài)變化規(guī)律的研究相對較少。

為進一步確定細(xì)胞因子在睡眠剝奪機制中的作用，本研究選用小鼠MMPM模型，觀察BDNF和IL-4的在急性睡眠剝奪的海馬組織的動態(tài)變化情況，探討細(xì)胞因子BDNF和IL-4與急性睡眠剝奪的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad公司)。Mouse-IL-4 ELISA Kit、Mouse-BDNF ELISA Kit(上海嵐派生物)。

1.2 動物分組 實驗動物為雄性C57BL/6J小鼠，共60只，均為6～8 周齡，體重在 20～25 g 之間，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所質(zhì)量檢測合格，并獲得天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。C57BL/6J雄性小鼠經(jīng)同籠性飼養(yǎng)1 w后隨機分為正常對照組(CC)、快速眼球運動(REM) 睡眠剝奪1 d組(SD 1 d)、REM 睡眠剝奪2 d組(SD 2 d)、REM 睡眠剝奪3 d組(SD 3 d)，每組12只小鼠。

1.3 小鼠REM 睡眠剝奪模型的建立 睡眠剝奪室保持光照(9：00～21：00)與黑暗(21：00～次日9：00)交替，光照由 40 W 日光燈照射模擬。室內(nèi)溫度(24±1) ℃，相對濕度 40%～70%。小鼠REM睡眠剝奪模型MMPM建立。睡眠剝奪箱為50 cm×30 cm×30 cm的水箱，均勻地放置8個圓形平臺，每次放入6只小鼠，空閑兩個平臺，小鼠可自由活動。向箱內(nèi)加入清水至平臺下方約1 cm，保持水溫20～25 ℃。箱上放置網(wǎng)蓋，保證小鼠不能跳出。

實驗開始前1 w將小鼠同籠飼養(yǎng)，并在水平臺上進行環(huán)境適應(yīng)。SD 1 d 組、SD 2 d組、SD 3 d組睡眠剝奪時間分別為24 h、48 h和72 h。用攝像頭觀察記錄小鼠睡眠剝奪的全過程，小鼠確實存在低頭觸水而驚醒的反應(yīng)。

1.4 標(biāo)本制備 待4組小鼠各自處理完畢后，分別隨機取出小鼠，以10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射，剪開胸腔，暴露心臟、肺及肝臟，剪開右心耳，將頭皮針插入左心室，頭皮針另一端連接預(yù)先于4 ℃預(yù)冷的100 ml 0.1 mol/L PBS，快速灌注，待灌流出的液體變淡直至清亮無色，此時肺及肝臟變白時提示灌注充分，停止灌注。將小鼠斷頭后取出腦組織，分離出雙側(cè)海馬，投入液氮中速凍，然后于-80℃凍存。

1.5 ELISA法 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定海馬組織勻漿液中BDNF、IL-4表達水平。測定儀器為瑞士infinite M200 Pro 酶標(biāo)儀。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA 法檢測不同時長睡眠剝奪小鼠海馬中 BDNF表達水平 小鼠海馬中BDNF的表達水平方差分析顯示SD 1 d組(561.583±25.279)pg/ml較CC組(516.417±24.481)pg/ml升高，差異具有顯著性(P=0.029)；SD 2 d組(509.150±31.469)pg/ml與CC組相比稍有降低，但差異并無顯著性(P>0.5)，與SD 1 d組相比降低，差異具有顯著性(P=0.009)；SD 3 d組(442.650±14.446)pg/ml與CC組相比降低，差異具有顯著性(P<0.001)，與SD 1 d組相比顯著降低(P<0.001)(見表1、表2、圖1)。

2.2 ELISA 法檢測不同時長睡眠剝奪小鼠海馬中 IL-4表達水平 小鼠海馬中IL-4的表達水平方差分析顯示SD 1 d組(111.767±4.199)pg/ml較CC組(96.217±3.279)pg/ml升高，差異具有顯著性(P<0.001)；SD 2 d組(90.983±2.586)pg/ml與CC組相比稍降低，但差異并無顯著性(P=0.13)，與SD 1 d組相比降低，差異具有顯著性(P<0.001)；SD 3 d組(75.967±4.227)pg/ml與CC組相比降低，差異具有顯著性(P<0.001)，與SD 1 d組相比顯著降低(P<0.001)(見表1、表2、圖2)。

2.3 Pearson相關(guān)性分析顯示睡眠剝奪過程中小鼠海馬中IL-4、BDNF蛋白表達變化呈正相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示睡眠剝奪過程中小鼠海馬中IL-4、BDNF蛋白表達變化呈正相關(guān)性，P<0.001，相關(guān)系數(shù)r=0.863(見圖3)。

表1 不同時長睡眠剝奪小鼠海馬組織ELISA結(jié)果(單位pg/ml)

表2 不同時長睡眠剝奪小鼠海馬組織ELISA方差分析

圖1 不同時長睡眠剝奪小鼠海馬組織BDNF含量

*P<0.05；**P<0.005

圖3 不同時長睡眠剝小鼠海馬BDNF、IL-4蛋白表達量相關(guān)性分析

3 討 論

急性短時間的睡眠剝奪與饑餓、創(chuàng)傷、缺氧等因素一樣，是一種應(yīng)激源，可造成機體的正常生理紊亂[2]。有實驗表明，機體的應(yīng)激反應(yīng)可以最終整合到海馬區(qū)，從而對機體的學(xué)習(xí)、記憶有著重要的作用[3]。本實驗顯示，急性睡眠剝奪24 h后小鼠海馬中BDNF蛋白表達水平稍有升高，與既往研究[4]顯示短時間的睡眠剝奪對導(dǎo)致BDNF水平的上調(diào)相一致?？赡芘c睡眠剝奪后體內(nèi)多種內(nèi)分泌系統(tǒng)激活，導(dǎo)致諸如多巴胺、去甲腎上腺素等激素上調(diào)有關(guān)[5]。本實驗顯示，隨睡眠剝奪時間的延長，海馬中BDNF水平逐漸下降。睡眠剝奪48 h時蛋白表達水平與對照組相比稍低(差異無統(tǒng)計學(xué)意義)；當(dāng)睡眠剝奪達到72 h時蛋白表達水平較對照組明顯降低。BDNF表達的減少，使BDNF對神經(jīng)元的有益作用減弱，對細(xì)胞功能造成影響。BDNF對海馬組織有重要的保護作用。BDNF在神經(jīng)細(xì)胞中的作用是通過與TrkB受體和p75受體結(jié)合而實現(xiàn)的。BDNF與TrkB受體結(jié)合后激活Ras/MEK、PI-3K/AKT、PLCc/PKC和PKA等多種信號傳導(dǎo)途徑[6]。BDNF的表達減慢了淀粉樣前體蛋白(APP)轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞變性的速度，降低細(xì)胞變性的程度，減弱Aβ 沉積造成的神經(jīng)毒性損害[7]。BDNF可引起腦啡肽酶介導(dǎo)的 Aβ 降解，保護神經(jīng)細(xì)胞[8]，通過Neuropep-1外源性上調(diào)BDNF表達，可提高TrkB的水平并減少淀粉樣斑塊的形成[9]。研究表明大腦神經(jīng)元BDNF表達水平較低的區(qū)域，神經(jīng)元纖維纏結(jié)增多[10]。Alzoubi等研究表明SD可以降低BDNF水平并損害記憶[11]。另有研究表明睡眠剝奪對海馬細(xì)胞增殖的不利影響可能在約48 h之后出現(xiàn)[12]。本研究證明較長時間的睡眠剝奪(72 h)降低了海馬中的BDNF水平，這可能是由于機體對睡眠剝奪后的應(yīng)激反應(yīng)隨著時間的延長逐漸衰減的結(jié)果，也有可能是睡眠剝奪造成海馬功能損傷導(dǎo)致記憶及認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機制之一。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，IL-4主要是由M2表型的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，IL-4水平的升高表明刺激朝向小膠質(zhì)細(xì)胞M2表型分化[13]。有實驗表明，通過暴露于IL-4誘導(dǎo)M2表型，小膠質(zhì)細(xì)胞的iNOS的表達水平顯著下調(diào)[14]。IL-4可通過調(diào)節(jié)急慢性巨噬細(xì)胞反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。IL-4可以促進小膠質(zhì)細(xì)胞的生長，增強吞噬活性并促進增殖，能抑制一氧化氮(NO)和促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IFN-γ的產(chǎn)生[16]。IL-4在AD患者腦內(nèi)的神經(jīng)炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[17]。然而，在急性睡眠剝奪時，大腦尤其是海馬中的IL-4的變化研究相對較少。本研究顯示，24 h的急性睡眠剝奪引起小鼠海馬中蛋白表達水平較對照組升高；48 h睡眠剝奪后小鼠海馬中的蛋白表達水平與對照組相比無明顯差異；當(dāng)睡眠剝奪達到72 h后，小鼠海馬中的蛋白表達水平較對照組降低。本研究顯示，隨著睡眠剝奪時間的延長，海馬中IL-4的水平顯示出先升高后降低的變化，這可能表示短時間(24 h)內(nèi)的睡眠剝奪時，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化時同樣可以部分地向M2表型轉(zhuǎn)化，升高IL-4水平以抵消M1表型引起的負(fù)性作用，這可能是機體的自我保護機制；當(dāng)睡眠剝奪時間延長至72 h時，IL-4水平降低，表明拮抗M1表型分泌的促炎因子的損害作用可能減弱，這造成了一定程度的炎癥失衡。有研究表明IL-4缺陷型小鼠表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知功能障礙[18]，因此睡眠剝奪造成IL-4動態(tài)變化可能是引起認(rèn)知功能損害的機制之一。

本實驗顯示，在睡眠剝奪過程中，小鼠海馬組織中的IL-4和BDNF蛋白表達量具有相同的先高(24 h)后低(72 h)的趨勢，由此，本研究對兩者是否具有相關(guān)性進行了進一步的探討。本實驗數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)性分析顯示，在小鼠睡眠剝奪過程中，海馬組織內(nèi)IL-4和BDNF蛋白表達量存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。IL-4與BDNF的相關(guān)性在其他疾病的研究中已有證實。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)體外實驗中，IL-4的應(yīng)用引起了BDNF水平升高并促進視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活[19]；在體內(nèi)實驗中，直接向老年大鼠海馬區(qū)注射IL-4可引起大鼠海馬組織中BDNF水平的上調(diào)并改善認(rèn)知功能[20]。另有實驗直接證明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的IL-4誘導(dǎo)的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌BDNF增加[21]。這些研究均表明，IL-4與BDNF之間具有正相關(guān)的關(guān)系，IL-4可以促進海馬內(nèi)BDNF的產(chǎn)生，這可能是IL-4產(chǎn)生保護性作用的另一機制。

綜上，本實驗通過ELISA法證明隨著睡眠剝奪時間延長，小鼠海馬組織內(nèi)的BDNF、IL-4呈現(xiàn)先高后低的趨勢；睡眠剝奪后BDNF、IL-4表達量的變化可能是睡眠剝奪后造成神經(jīng)損傷的可能機制之一。