游思亮 王青

摘要 [目的]研究多種因素對大豆粗蛋白含量測定的影響，以期獲得最優(yōu)化的試驗條件。[方法]利用全自動凱氏定氮儀比較不同稱樣量、催化劑比例、硫酸用量、消化時間、消化溫度條件下測定的大豆粗蛋白含量。[結(jié)果]當(dāng)只改變某一種試驗條件的水平時，大豆粗蛋白含量測定結(jié)果之間差異較大，有的甚至達(dá)到極顯著水平。針對大豆樣本，較優(yōu)化的試驗條件是稱樣量0.5 g、催化劑用量比例K2SO4/CuSO4·5H2O為6/0.2（g/g）、硫酸用量為8 mL、消化時間105 min、消化溫度420 ℃。儀器測定硫酸銨的回收率為100.26%，符合定量的要求。[結(jié)論]該研究為其他相關(guān)研究提供方法借鑒。

關(guān)鍵詞 全自動凱氏定氮儀;大豆;粗蛋白含量

中圖分類號 TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）14-0213-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.063

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract [Objective]The research aimed to study the effects of various factors on the determination of soybean crude protein content in order to obtain optimal experimental conditions.[Method]Soybean crude protein content was measured by using automatic kjeldahl analyzer under different conditions， which include sample amount， ratio of catalyst， sulfuric acid amount， digesting time and digesting temperature. [Result]When only the level of a certain test condition was changed， the difference between the determination results of the soybean crude protein content was large， and some even reached a very significant level.For the soybean samples， the optimized experimental conditions were 0.5 g soybean sample， the ratio of catalyst to K2SO4/CuSO4·5H2O was 6 g/0.2 g， the amount of sulfuric acid was 8 mL， the digestion time was 105 min， and the digestion temperature was 420 ℃.The recovery of （NH4）2SO4 by using automatic kjeldahl analyzer was 100.26%， which was suitable for quantitative analysis.[Conclusion]This study provides a methodological reference for other related research.

Key words Automatic kjeldahl analyzer;Soybean;Crude protein content

作者簡介 游思亮（1984—），男，湖北武漢人，實驗師，碩士，從事作物遺傳分析與生理生化檢測研究。

收稿日期 2019-01-16

大豆作為我國重要的糧食作物，已有5 000多年的栽培歷史，其種子含有豐富的植物蛋白。同時，大豆的蛋白質(zhì)含量作為衡量大豆品質(zhì)好壞的一項重要指標(biāo)被重點關(guān)注。目前，測定大豆蛋白質(zhì)含量的方法是國標(biāo)方法GB/T 5511—2008中推薦的凱氏定氮法[1]。

凱氏定氮法自1833年被丹麥化學(xué)家凱道爾創(chuàng)立以來，因為其結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉、操作相對簡單等特點，被當(dāng)作測定不同類型樣本蛋白質(zhì)含量的黃金標(biāo)準(zhǔn)[2]，隨后更是發(fā)展出了常量、微量、半微量凱氏定氮法以及自動定氮法。凱氏定氮法的原理是將催化劑和濃硫酸同時加入樣品中，加熱消化，樣品中的有機氮與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨;然后加入過量的堿，并蒸餾使硫酸銨轉(zhuǎn)化為氨氣，氨氣被硼酸吸收反應(yīng)生成硼酸銨;隨后用標(biāo)準(zhǔn)滴定鹽酸溶液滴定，由于硼酸中有甲基紅和溴甲酚綠指示劑，通過指示劑顏色變化可判斷滴定終點，最后根據(jù)滴定鹽酸溶液的消耗量計算樣品中的含氮量，再乘以樣品對應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)，得到樣品的粗蛋白含量[3-5]。大豆及大豆制品中氮換算成蛋白質(zhì)系數(shù)，國內(nèi)多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)采用6.25[6]。從凱氏定氮法的原理可知，這種方法實際上測的是樣品中蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮物（如核酸、生物堿、含氮類脂等），也就是粗蛋白含量[7]。而且，凱氏定氮法測定樣品總氮含量時有一定的局限性，這種方法無法測定土壤中N-O或N-N鍵結(jié)合的氮化合物，如硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、硝基、亞硝基、偶氮化合物[8]等，還需要做進一步改進。

全自動凱氏定氮儀可同時消化多個樣品，且自動完成后續(xù)的蒸餾、滴定步驟，減少了人為操作導(dǎo)致的試驗誤差，目前被研究者廣泛使用[9]。也正因為測定步驟不需要人為參與，因此，對于使用全自動凱氏定氮儀的用戶來說，影響試驗結(jié)果最關(guān)鍵的步驟是樣品的消化。有學(xué)者討論了一些影響消化的因素，但是不夠全面[10]。筆者從多個方面詳細(xì)比較了各因素對大豆粗蛋白含量的影響，以期獲得最優(yōu)化的試驗條件，為即將開展的研究打下基礎(chǔ)，也為相關(guān)研究者提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器。Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀（FOSS）、DT220消化儀（FOSS）、CT410旋風(fēng)磨（FOSS）、BS214D分析天平（Sartorius）、Milli-Q超純水機（Millipore）。

1.1.2 試劑。濃硫酸（AR）;40%氫氧化鈉（AR）;1%硼酸（AR）;指示劑0.1%甲基紅和0.1%溴甲酚綠均用無水乙醇配制，每1 L硼酸溶液中加入7 mL甲基紅和10 mL溴甲酚綠;滴定鹽酸溶液（標(biāo)定濃度為0.102 1 mol/L）;配試劑所用的水均為去離子水。測定所用250 mL消化管均在試驗前用超聲波清洗儀清洗，然后用自來水和純水沖洗并烘干。

1.1.3 試材。試驗材料為遺傳轉(zhuǎn)化常用大豆品種杰克，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心提供。

1.2 試驗設(shè)計

該研究根據(jù)蛋白質(zhì)測定國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 5511—2008，利用Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀測定大豆種子中的粗蛋白含量。根據(jù)儀器推薦方法，取破碎后混勻的大豆粉，研究樣品量、催化劑比例、濃硫酸用量、消化時間、消化溫度對大豆粗蛋白含量的影響。每次試驗設(shè)置其中一項為變量，分別研究每個因素對測試結(jié)果的影響。設(shè)置樣品量處理分別為0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 g;催化劑（K2SO4/CuSO4·5H2O）比例處理分別為6/0.05、6/0.1、6/0.2、6/0.5、6/1.0（g/g）;濃硫酸用量處理分別為6、8、10、12、15 mL;消化時間處理為60、75、90、105、120 min;消化溫度處理為330、360、390、420、440 ℃（消化儀最高設(shè)置溫度）、250 ℃+420 ℃（0.5 h+1 h）。每個處理設(shè)置3次重復(fù)，且每個測定批次都做3個空白對照（加催化劑和硫酸，不加樣品）。

1.3 回收率的測定方法

將純度>99.5%的硫酸銨在102 ℃烘4 h，準(zhǔn)確稱取0.15 g（精確至小數(shù)點后第4位）放入消化管，按照儀器設(shè)定程序測定硫酸銨的回收率，重復(fù)6次，以空的消化管作為空白對照，重復(fù)3次。

實際含氮量=（V-V0）×N×14.007×100/樣品重量×100%;回收率=實際含氮量/21.09×100%，式中，V為滴定所用鹽酸體積，V0為空白對照所用鹽酸體積，N為滴定鹽酸的當(dāng)量濃度（精確至小數(shù)點后第4位），樣品重量單位為mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 稱樣量對大豆粗蛋白含量的影響

大豆屬于粗蛋白含量比較高的樣品，對于這類樣品，需要適當(dāng)控制樣品總量，儀器要求的樣品總含氮量不能超過200 mg，但是樣品量太少會放大測試過程中的人為操作以及儀器誤差，使測定結(jié)果不準(zhǔn)。在K2SO4/CuSO4·5H2O為6 g/0.2 g、濃硫酸用量為10 mL、消化時間為90 min、消化溫度為420 ℃時，不同稱樣量條件下測得的結(jié)果如圖1所示。稱樣量為0.5 g時結(jié)果最大，且與稱樣量0.75 g結(jié)果差異顯著，隨著稱樣量增大，測量結(jié)果下降。這一點從試驗情況可以驗證，當(dāng)稱樣量≤0.75 g時，消化液呈現(xiàn)清澈藍(lán)綠色或者綠色;當(dāng)稱樣量≥1.0 g時，消化液呈現(xiàn)渾濁的黑色，渾濁的黑色表明樣品消化不完全。所以，對于大豆這種蛋白質(zhì)含量比較高的樣品，應(yīng)該控制稱樣量不能超過0.75 g，以0.50 g左右為宜。

2.2 催化劑比例對大豆粗蛋白含量的影響

硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑在化學(xué)反應(yīng)過程中有著不同的作用。硫酸鉀可提高濃硫酸的沸點，促進有機物分解，硫酸銅可加快反應(yīng)速度，并作為堿性反應(yīng)指示劑。如果催化劑加入量太少，樣品消化時間會延長，如果催化劑加入太多，樣品消化不完全，會使結(jié)果偏低。在稱樣量為0.5 g、濃硫酸用量為10 mL、消化時間為90 min、消化溫度為420 ℃時，不同的催化劑比例條件下測得的結(jié)果如圖2所示。當(dāng)催化劑比例K2SO4/CuSO4·5H2O為6 g/0.2 g時，測量結(jié)果最大，除了與6 g/1.0 g處理組結(jié)果差異不顯著，與其他處理組均差異顯著，所以，應(yīng)該選擇加入催化劑比例K2SO4/CuSO4·5H2O為6 g/0.2 g。

2.3 濃硫酸用量對大豆粗蛋白含量的影響

消化用的濃硫酸對純度和濃度要求較高，應(yīng)該使用分析純及以上規(guī)格的濃硫酸。消化時如果濃硫酸用量過少，會導(dǎo)致樣品無法完全分解，使得測試結(jié)果偏低，如果用量過多，會導(dǎo)致試劑浪費并產(chǎn)生環(huán)境污染。同時，濃硫酸的使用量需要根據(jù)樣品的類型進行調(diào)整，對于高脂或高碳水化合物的樣品，需要適當(dāng)加大濃硫酸用量。目前常用的硫酸鉀和濃硫酸添加比例有2種，一種是1 g樣品中加入7 g硫酸鉀和12 mL硫酸，另一種是1 g樣品中加入10 g硫酸鉀和20 mL硫酸[11]。 在稱樣量為0.5 g、K2SO4/CuSO4·5H2O為6 g/0.2 g、消化時間為90 min、消化溫度為420 ℃時，不同濃硫酸使用量條件下測得的結(jié)果如圖3所示。當(dāng)硫酸用量在8 mL時，測量結(jié)果最大，顯著高于12 mL處理組，與其他處理組差異不顯著，所以，應(yīng)選擇8 mL硫酸用量比較合適。

2.4 消化時間對大豆粗蛋白含量的影響

消化時間太短會使得樣品無法充分消化分解，試驗結(jié)果偏低，消化時間太長則影響試驗效率，一般消化時間以消化液變成藍(lán)綠色清澈透明的液體之后，繼續(xù)消化30 min為宜。在稱樣量為0.5 g、K2SO4/CuSO4·5H2O為6 g/0.2 g、濃硫酸用量為8 mL、消化溫度為420 ℃時，不同消化時間條件下，測得的結(jié)果如圖4所示。隨著消化時間的延長，測定結(jié)果上升，在105 min時結(jié)果最大，105 min消化時間的結(jié)果除與120 min差異不顯著外，與其他處理組結(jié)果差異顯著，所以消化時間選定105 min比較合理。

2.5 消化溫度對大豆粗蛋白含量的影響

較高的消化溫度能保證樣品被快速消化，但是在消化前段，由于蛋白質(zhì)尚未轉(zhuǎn)化成銨鹽，溫度過高會使含氮物質(zhì)揮發(fā)，致使檢測結(jié)果偏低。因此，消化前段溫度應(yīng)控制在250～300 ℃，后段可將溫度控制在360～410 ℃[12]。在稱樣量為0.5 g、K2SO4/CuSO4·5H2O為6 g/0.2 g、濃硫酸用量為8 mL、消化時間為105 min時，不同消化溫度條件下，測得的結(jié)果如圖5所示，當(dāng)消化溫度高于420 ℃，測定結(jié)果之間差異不顯著，而且低溫加高溫與直接高溫處理組之間結(jié)果差異不明顯，所以，實際操作過程中可以直接高溫消化。390 ℃的處理組與420 ℃處理組差異達(dá)到顯著水平，與440 ℃處理組差異達(dá)到極顯著水平。而且隨著消化溫度繼續(xù)降低，測定結(jié)果也隨之降低，390 ℃與360 ℃處理組測定結(jié)果差異顯著。綜合以上結(jié)果，消化溫度對大豆粗蛋白測定結(jié)果的影響巨大，對于大豆樣品，應(yīng)該選擇≥420 ℃的消化溫度。另外，由于消化儀的最高設(shè)置溫度為440 ℃，為了儀器安全考慮，可以選擇稍低一點的420 ℃作為消化溫度。

2.6 儀器的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性驗證試驗

通過測定已知含氮量硫酸銨的回收率來評價凱氏定氮儀的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，純度≥99.5%的硫酸銨理論含氮量為21.09%。6次測定結(jié)果的回收率分別為99.26%、100.01%、100.58%、100.62%、100.60%、100.48%，儀器對硫酸銨的回收率平均值是100.26%，RSD為0.54%，符合回收率99.5%～100.5%的定量要求，說明儀器準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)論與討論

利用Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀來測定大豆種子粗蛋白含量，較為優(yōu)化的消化條件為稱樣量0.5 g、催化劑比例K2SO4/CuSO4·5H2O為6 g/0.2 g、硫酸用量8 mL、消化時間105 min、消化溫度420 ℃。

雖然凱氏定氮法有諸多優(yōu)點，但不可否認(rèn)它也有缺點，如檢測時間長、所用試劑有很強的腐蝕性、測定的氮是總有機氮而不是蛋白質(zhì)氮等。近年來，近紅外光譜法作為一種新興的蛋白質(zhì)測定技術(shù)，由于其測定時間短、不用消耗任何化學(xué)試劑、試驗過程無污染、樣品基本不用預(yù)處理、結(jié)果準(zhǔn)確性幾乎可媲美傳統(tǒng)凱氏定氮法等優(yōu)點，正在越來越多的領(lǐng)域得到應(yīng)用[13-17]，在某些應(yīng)用領(lǐng)域甚至有可能取代傳統(tǒng)方法，有很好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.谷物和豆類 氮含量測定和粗蛋白質(zhì)含量計算 凱氏法：GB/T 5511—2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[2] LYNCH J M，BARBANO D M.Kjeldahl nitrogen analysis as a reference method for protein determination in dairy products[J].J AOAC Int，1999，82（6）：1389-1398.

[3] MICHALOWSKI T，ASUERO A G，WYBRANIEC S.The titration in the Kjeldahl method of nitrogen determination：Base or acid as titrant[J].J Chem Educ，2013，90（2）：191-197.

[4] SEZPLAZA P，MICHALOWSKI T，NAVAS M J，et al.An overview of the Kjeldahl method of nitrogen determination.Part I.Early history，chemistry of the procedure，and titrimetric finish[J].Crit Rev Anal Chem，2013，43（4）：178-223.

[5] SEZPLAZA P，NAVAS M J，WYBRAINIEC S，et al.An overview of the Kjeldahl method on nitrogen determination.Part II.Sampling preparation，working scale，instrumental finish，and quality control[J].Crit Rev Anal Chem，2013，43（4）：224-272.

[6] 國家市場監(jiān)督管理總局.飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法：GB/T 6432—2018[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

[7] 丁衛(wèi)新.全自動定氮儀在小麥粗蛋白檢驗中的應(yīng)用與研究[J].糧食加工，2012，37（4）：24-26.

[8] KUBOTA T，OSHIDA T，YANAI K，et al.Improvement of the conditions for the determination of total nitrogen in fish meal in Kjeldahl method and its comparison with Dumas method[J].Bunseki Kagaku，2011，60（1）：67-74.

[9] 史瑋，孫瑩，徐振斌.凱氏定氮法測定糧食蛋白質(zhì)含量方法研究[J].糧食科技與經(jīng)濟，2013，38（5）：31-32.

[10] 徐新娟，黃中文，王偉，等.全自動凱氏定氮儀測定大豆蛋白質(zhì)方法的研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（2）：108-110，121.

[11] 馬丹.凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)含量[J].計量與測試技術(shù)，2008（6）：57-58.

[12] 羅小芬.淺談凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)準(zhǔn)確度的操作技巧及關(guān)鍵點[J].現(xiàn)代食品，2017（19）：99-100.

[13] DABKIEWICZ V E，DE MELLO PEREIRA ABRANTES S，CASSELLA R J.Development of a nondestructive method for determining protein nitrogen in a yellow fever vaccine by near infrared spectroscopy and multivariate calibration[J].Spectrochimica acta part A：Molecular and biomolecular spectroscopy，2018，201：170-177.

[14] INGLE P D，CHRISTIAN R，PUROHIT P，et al.Determination of protein content by NIR spectroscopy in protein powder mix products[J].J AOAC Int，2016，99（2）：360-363.

[15] MOURYA V，KUMAR V，RANI A，et al.Nearinfrared reflectance spectroscopy for protein content in soybean flour and screening of germplasm across different countries[J].Agricultural research，2016，5（1）：29-34.

[16] 溫冰消，劉衛(wèi)國，李虹橋，等.基于近紅外法的鮮食大豆品質(zhì)快速分析技術(shù)[J].分子植物育種，2018，16（12）：4062-4067.

[17] 趙影，王文和，滕嬌琴，等.兩種儀器測定國產(chǎn)大豆粗蛋白含量的比較[J].糧食儲藏，2018，47（4）：37-39，44.