王崢嶸 李建民 薛念濤 董志英

摘要 為深入了解CASS系統(tǒng)內(nèi)的反硝化除磷污泥微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)反應(yīng)器內(nèi)初始接種污泥和馴化成功的污泥進(jìn)行高通量測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果顯示CASS系統(tǒng)反硝化除磷污泥中富集了一定比例的、具有脫氮除磷能力的菌群，優(yōu)勢(shì)菌群主要有變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。目水平上鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）和紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）豐度增長較大，科水平上紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）的豐度增長最大，可能包含具有反硝化功能的菌群。此分析結(jié)果也顯示出CASS系統(tǒng)具有一定的脫氮除磷功能。

關(guān)鍵詞 反硝化除磷污泥;CASS反應(yīng)器;高通量測(cè)序;微生物菌群

中圖分類號(hào) X703.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）14-0071-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.023

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Microbial Community Structure of Denitrifying Phosphorus Removal Sludge in CASS Reactor

Abstract To further understand the microbial community structure of denitrifying phosphorus removal sludge in CASS system，high throughput sequencing analysis was carried out for initial inoculation sludge and domesticated sludge.The results of high throughput sequencing showed that a certain proportion of bacteria with nitrogen and phosphorus removal ability were enriched in the sludge of denitrifying phosphorus removal in CASS system，and the dominant bacteria were mainly Proteobacteria，Chloroflexi and Bacteroidetes.Sphingobacteriales and Rhodocyclales increased the more abundances at the order level，Rhodocyclaceae increased the most abundances at the family level，possibly including denitrifying bacteria.The results also showed that the CASS system had a certain function of nitrogen and phosphorus removal.

Key words Denitrifying phosphorus removal sludge;CASS reactor;High throughput sequencing;Microbiology community

作者簡介 王崢嶸（1994—），女，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向：水污染控制。*通信作者，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事水污染控制研究。

收稿日期 2019-03-04

污水處理系統(tǒng)中，微生物群落多樣性與系統(tǒng)穩(wěn)定性成正比，豐富的微生物種群有利于抵抗沖擊負(fù)荷和維護(hù)系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行。少數(shù)優(yōu)勢(shì)菌群主導(dǎo)的微生物群落可能穩(wěn)定性不足，但富含重要的功能菌群。呂小梅[1]對(duì)反硝化除磷污泥與傳統(tǒng)好氧除磷污泥的菌群結(jié)構(gòu)與主導(dǎo)除磷微生物的差異性進(jìn)行比較，認(rèn)為好氧除磷污泥多樣性高于反硝化除磷污泥，2種污泥的核心功能菌群不同，在馴化過程中，好氧除磷污泥菌群結(jié)構(gòu)僅有微小波動(dòng)，而反硝化除磷污泥的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，也有其他研究得到了一致的結(jié)論[2]。周康群等[3]采用SBR富集反硝化聚磷菌，發(fā)現(xiàn)DNPAOs濃度增加為原來的57倍，富集后菌種種類減少且更加集中，主要為假單胞菌屬、棒狀桿菌屬、腸桿菌科和葡萄球菌屬。

生物分類基本單元為界、門、綱、目、科、屬、種，種為基本單元，微生物分類學(xué)可以用于初步判斷不同菌群的生物功能特征。對(duì)反硝化除磷污泥在門水平上的生物學(xué)研究較多，發(fā)現(xiàn)變形菌門（Proteobacteria）為反硝化除磷污泥主導(dǎo)菌群，對(duì)氮磷去除起著重要作用，馴化過程中下屬綱水平上α-、β-、δ-Proteobacteria有明顯變化[4]。目、屬水平更深入體現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)差異，Acinetobacter是最早被鑒定為具有除磷作用的微生物[5]，在強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)除磷效果較好的穩(wěn)定期內(nèi)大量存在[6]，但吳昌永等[7]發(fā)現(xiàn)在A2O工藝反硝化除磷強(qiáng)化的過程中，Acinetobacter逐漸消失，認(rèn)為Acinetobacter在反硝化除磷工藝中不占優(yōu)勢(shì)。A/A反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定期Xanthomonadales、Rhodocyclales、Burkholderiales為主導(dǎo)菌，Methylibium、Thauera為主導(dǎo)菌屬，系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)菌群的變化也引起了系統(tǒng)功能的改變[8]。

目前很多報(bào)道的反硝化除磷菌屬都基于實(shí)驗(yàn)室平板純培養(yǎng)分離的方式得到的結(jié)果，不能反映實(shí)際工藝中的微生物群落組成。該研究采用CASS工藝富集培養(yǎng)反硝化聚磷菌，反應(yīng)器顯示出了良好的反硝化脫氮效果，出水COD、TP、TN、氨氮平均去除率超過90%，反硝化聚磷菌群成為系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌群[9]。為深入了解反硝化除磷污泥微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的變化，探究DNPAOs主導(dǎo)菌群特點(diǎn)及功能，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，以CASS富集培養(yǎng)反硝化聚磷菌前后活性污泥為對(duì)象，對(duì)反硝化聚磷菌群落組成進(jìn)行微生物多樣性和分類學(xué)分析，以期進(jìn)一步探索反硝化除磷污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)，為反硝化除磷技術(shù)的實(shí)際推廣應(yīng)用提供理論支持。

為考察在脫氮除磷方面發(fā)揮主要作用的菌群組成，對(duì)2個(gè)樣品中豐度最大的菌群變形菌門在綱分類水平的分布特征進(jìn)行進(jìn)一步的分析，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，β-變形菌綱（βProteobacteria）的豐度在2個(gè)樣品中占比最大，分別為13.99%和19.83%。β-Proteobacteria菌群在脫氮除磷方面有著重要貢獻(xiàn)，吳昌永等[7]富集到了一種屬于βProteobacteria的新功能菌群Uncultured Chlorobibacterium;Ahn等[14]研究了DNPAOs的生物組成，SBR反應(yīng)器中常見2種細(xì)菌Rhodoyclus和Dechlorimonas，屬于βProteobacteria。有2種菌種都屬于βProteobacteria，該菌群比例的提高證明了CASS系統(tǒng)對(duì)脫氮除磷菌群的富集能力。對(duì)比2個(gè)樣品，δ-變形菌綱（δProteobacteria）和γ-變形菌綱（γProteobacteria）的豐度均增加數(shù)倍，γProteobacteria可能包含具有反硝化脫氮能力以及除磷能力的菌群[15-16]，還未見有關(guān)于δ-變形菌綱（δProteobacteria）具有反硝化除磷性能的報(bào)道。

如圖5所示，在目分類水平上，1號(hào)樣品的主要菌群為紅色桿菌目（Rubrobacterales）、酸微菌目（Acidimicrobiales） 、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）、紅螺菌目（Rhodospirillales）、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）和JG30-KF-CM45，2號(hào)樣品的主要菌群有鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）、紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）、酸微菌目（Acidimicrobiales）、克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、黃色單胞菌目（Xanthomonadales）和粘球菌目（Myxococcales）。對(duì)比2個(gè)樣品菌群的變化情況發(fā)現(xiàn)，鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）的豐度由2.62%上升至10.97%，紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）由不到1.00%上升至9.65%，可能包含具有反硝化功能的菌群[17-18]。此外，Bond等[19]研究表明，紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）相關(guān)微生物是生物除磷系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)聚磷菌。因此，從目的水平上微生物種群分析來看，CASS系統(tǒng)富集了具有脫氮除磷能力的物種，可能是反硝化聚磷菌。

在科分類水平上，1號(hào)污泥樣品和2號(hào)污泥樣品中微生物群落組成如圖6所示。其中，1號(hào)樣品主要包含Norank_O_JG30-KF-CM45、Elev-16S-1332、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）和酸微菌科（Acidimicrobiales），2號(hào)樣品主要包含紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）、腐螺旋菌科（Saprospiraceae）和叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）。Fahrbach等[20]從城市污水處理廠的活性污泥中分離得到一株革蘭氏陰性反硝化細(xì)菌Denitratisoma，是紅環(huán)菌科的一個(gè)新屬，具有好氧反硝化能力。對(duì)比樣品1和樣品2的菌群豐度變化，紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）的豐度增長較大。紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）是除磷系統(tǒng)的主要構(gòu)成菌群，并且可能具有反硝化功能，紅環(huán)菌可能含有反硝化聚磷菌。

3 結(jié)論

與初始接種污泥相比，CASS系統(tǒng)中反硝化除磷污泥中富集了一定比例的具有脫氮除磷能力的菌群，優(yōu)勢(shì)菌群主要有變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中β-變形菌綱（β-Proteobacteria）的豐度占比較大。放線菌門相較初始接種污泥降幅明顯，證明了CASS有助于減少污泥膨脹的優(yōu)勢(shì)。

鞘脂桿菌目（Sphingobacteriales）和紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）豐度增長較大，可能包含具有反硝化功能的菌群。其中紅環(huán)菌科（Rhodocyclaceae）是除磷系統(tǒng)的主要構(gòu)成菌群，并且可能具有反硝化功能，可推斷紅環(huán)菌含有反硝化聚磷菌。

參考文獻(xiàn)

[1] 呂小梅.反硝化除磷菌群結(jié)構(gòu)與工藝調(diào)控策略[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2014.

[2] 周俊.反硝化除磷顆粒污泥反應(yīng)器快速啟動(dòng)及其功能菌群作用機(jī)制研究[D].武漢：武漢大學(xué)，2016.

[3] 周康群，劉暉，孫彥富，等.反硝化聚磷菌的SBR反應(yīng)器中微生物種群與濃度變化[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，39（4）：705-711.

[4] ZHANG T，SHAO M F，YE L.454 Pyrosequencing reveals bacterial diversity of activated sludge from 14 sewage treatment plants [J].The ISME Journal，2012，6（6）：1137-1147.

[5] FUHS G W，CHEN M.Microbiological basis of phosphate removed in the activated sludge process for the treatment of wastewater[J].Microbial ecology，1975，2（2）：119-138.

[6] 李偉光，田文德，康曉榮，等.強(qiáng)化生物除磷工藝微生物種群結(jié)構(gòu)分析[J].化工學(xué)報(bào)，2011，62（12）：3532-3538.

[7] 吳昌永，彭永臻，王淑瑩，等.強(qiáng)化反硝化除磷對(duì)A2O工藝微生物種群變化的影響[J].化工學(xué)報(bào)，2010，61（1）：186-191.

[8] 熊付娟.反硝化除磷污泥除磷脫氮特性及菌群結(jié)構(gòu)研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2013.

[9] 劉康，薛念濤，李建民，等.CASS反應(yīng)器內(nèi)反硝化聚磷菌處理生活污水的性能[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2018，12（9）：2483-2489.

[10] 聞韻，王曉慧，林常青.Miseq測(cè)序分析活性污泥系統(tǒng)中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2015，9（11）：5225-5230.

[11] CHANG Y M，YANG Q，HAO C B，et al.Experimental study of autotrophic denitrification bacteria through bioaugmentation of activated sludge from municipal wastewater plant [J].Environmental science，2011，32（4）：1210-1216.

[12] CAROLINE K，CATERINA L，ARJAN B，et al.Identity abundance and ecophysiology of filamentous bacteria belonging to the Bacteroidetes present in activated sludge plants[J].Microbiology，2008，154（3）：886-894.

[13] 王亞超，南亞萍，袁林江，等.A2/O和SBR系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)比較分析[J].工業(yè)微生物，2017（6）：25-30.

[14] AHN J，DAIDOU T，TSUNEDA S，et al.Characterization of denitrifying phosphate-accumulating organisms cultivated under different electron acceptor conditions using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis assay[J].Water research，2002，36（2）：403-412.

[15] 金云霄.智能化控制SBBR處理城市污水脫氮除磷性能和微生物學(xué)研究[D].北京：中國地質(zhì)大學(xué)，2011.

[16] 羅曉，鄭向陽，趙叢叢，等.A/O工藝中污泥濃度對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國環(huán)境科學(xué)，2018，38（1）：275-283.

[17] 方芳，王淑梅，馮翠杰，等.好氧條件下復(fù)合生物膜-活性污泥反應(yīng)器中的反硝化菌群結(jié)構(gòu)[J].生態(tài)學(xué)雜志，2011，30（3）：430-437.

[18] 駱靈喜，劉歡，李旭寧，等.膜生物反應(yīng)器異養(yǎng)硝化菌的篩選與硝化特性研究[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2015，15（6）：132-135.

[19] BOND P L，ERHART R，WAGNER M，et al.Identification of some of the major groups of bacteria in efficient and nonefficient biological phosphorus removal activated sludge systems[J].Applied and environmental microbiology，1999，65（9）：4077-4084.

[20] FAHRBACH M，KUEVER J，MEINKE R，et al.Denitratisoma oestradiolicum gen.nov.，sp.nov.，a 17β-oestradiol-degrading，denitrifying betaproteobacterium[J].International journal of systermatic and evolutionary microbiology，2006，56（7）：1547-1552.