孟帆 趙岳 樊振華 吳忻 薛翼鵬 米瑞娟 姚敬明

摘要 [目的]了解豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗的免疫效果，同時(shí)制定合理的免疫程序。[方法]選用國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口2種豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，采用2種不同的免疫程序進(jìn)行了免疫對(duì)比試驗(yàn)。[結(jié)果]無論是用國(guó)產(chǎn)的還是進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫，試驗(yàn)豬10、20、30、40、50、60、70日齡豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）;80日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值顯著高于2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.05）;90、100、115日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值極顯著高于2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.01）。整個(gè)試驗(yàn)期，通過對(duì)國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫效果的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）。[結(jié)論]該免疫試驗(yàn)結(jié)果可為豬偽狂犬病免疫防控程序的應(yīng)用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 豬偽狂犬病;gE基因缺失活疫苗;免疫試驗(yàn)

中圖分類號(hào) S859文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）14-0091-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.14.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] To understand the immune effect of gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus and establish reasonable immune procedure.? [Method] Domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus were selected and 2 different immune procedures were used to conduct the immune contrast test. [Result] There was no significant difference（P>0.05）of the average S/N mean value of gB antibody against porcine pseudorabies virus between domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus at 10，20，30， 40，50， 60，70 dayages.? And the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus in the third immunization group was significantly higher than that in the second immunization group （P<0.05） at 80dayage. At 90，100，115 dayages， the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus in the third immunization group was significantly higher than that in the second immunization group（P<0.01）. During the whole trial period，? there was no significant difference in the average S/N value of gB antibody against porcine pseudorabies virus between domestic and imported gEgenedeleted attenuated vaccine of pseudorabies virus among all groups （P>0.05）. [Conclusion]The research results could provide the basis for the application of the immune prevention and control program of pseudorabies in pigs.

Key words Pseudorabies;gEgenedeleted attenuated vaccine;Immunity test

作者簡(jiǎn)介 孟帆（1980—），女，山西太原人，副研究員，碩士，從事動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢測(cè)與診斷技術(shù)研究。*通信作者，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事動(dòng)物疫病分子生物學(xué)檢測(cè)與診斷技術(shù)研究。

收稿日期 2018-12-10

豬偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是一種由豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染導(dǎo)致的一種以發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎為主的高度接觸性、急性傳染病[1-3]。該病的主要宿主和傳染源是豬[4]， 可通過消化道和呼吸道傳播，也可通過交配、精液、胎盤垂直傳播。

該病自1902年匈牙利首次被發(fā)現(xiàn)以來廣泛分布于世界各地，已有50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道該病的流行。我國(guó)自1948年首次報(bào)道該病后，迄今已有多個(gè)省份相繼報(bào)道了該病， 并在許多種豬場(chǎng)呈暴發(fā)流行趨勢(shì)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)特別是集約化養(yǎng)豬造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。近年來種豬場(chǎng)對(duì)該病的免疫防控非常重視，但在臨床上母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊以及仔豬神經(jīng)癥狀等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。筆者從不同地市的11個(gè)規(guī)模型種豬場(chǎng)采集血樣，用豬偽狂犬病gE抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)母豬豬偽狂犬病野毒感染率為57.94%，仔豬感染率為34.66%，達(dá)到凈化該病的目標(biāo)任務(wù)還很艱巨。筆者選用國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，對(duì)仔豬進(jìn)行2次或3次免疫試驗(yàn)，旨在為選擇疫苗、探索有效的免疫程序提供科學(xué)依據(jù)，為有效控制該病的流行提供一種技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試劑盒。豬偽狂犬病病毒gB 和gE 蛋白ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)豬群。近幾年來對(duì)20個(gè)示范豬場(chǎng)檢測(cè)豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒免疫抗體和感染抗體的基礎(chǔ)上，選擇大同陽高×種豬場(chǎng)（gE抗體檢測(cè)為陰性），2015年9月在免疫試驗(yàn)前對(duì)該豬場(chǎng)母豬每次免疫后進(jìn)行跟蹤檢測(cè)豬偽狂犬病病毒gB 和gE抗體，2016年9月對(duì)該豬場(chǎng)不同日齡仔豬進(jìn)行了抽查檢測(cè)，再次確定該豬場(chǎng)母豬、仔豬豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)全部為陰性時(shí)，選擇該場(chǎng)60頭母豬，300頭仔豬為試驗(yàn)豬群。

1.1.3 試驗(yàn)疫苗。進(jìn)口、國(guó)產(chǎn)豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗分別購(gòu)自美國(guó)某公司和上海某生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫。在試驗(yàn)場(chǎng)根據(jù)母豬懷孕產(chǎn)子情況，選擇60頭母豬、300頭仔豬，隨機(jī)分成4組，每組選擇40頭左右仔豬進(jìn)行免疫試驗(yàn)。

試驗(yàn) Ⅰ 組：用美國(guó)某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡注射，劑量1頭份/頭。試驗(yàn)Ⅱ組：用美國(guó)某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡、65日齡注射，劑量1頭份/頭。試驗(yàn)Ⅲ組：用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡注射，劑量1頭份/頭。試驗(yàn)Ⅳ組：用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬母豬每年2、5、8、11月進(jìn)行4次普防，劑量2頭份/頭;仔豬1日齡滴鼻，35日齡、65日齡注射，劑量1頭份/頭。

1.2.2 采血時(shí)間及方式。對(duì)母豬每次免疫后20 d從頸靜脈或耳靜脈隨機(jī)采集血樣20頭，每頭采血3～5 mL，檢測(cè)1次gB 和gE抗體。對(duì)免疫試驗(yàn)仔豬，每10 d定時(shí)隨機(jī)從試驗(yàn)豬前腔靜脈采集血樣10份左右，每份采血3～5 mL，并及時(shí)分離血清，-20 ℃下冷凍保存，備用。

1.2.3 抗體檢測(cè)和判定方法。采用阻斷 ELISA 法進(jìn)行抗體檢測(cè)，具體步驟嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒使用說明書進(jìn)行操作）。

1.2.3.1 抗體檢測(cè)方法。首先配制洗滌液，稀釋樣品及陰性、陽性對(duì)照，取抗原包被板設(shè)置陰性和陽性對(duì)照，加樣后37 ℃孵育，再棄去孔中液體，用洗滌液洗板;然后，加酶標(biāo)記物37 ℃孵育，用洗滌液洗板。接著，再加入底物液A、B 混合于室溫（20～25 ℃）避光顯色，最后加入終止液混勻后在10 min內(nèi)于 630 nm 處測(cè)定各孔的OD 值。

1.2.3.2 結(jié)果判定。

（1）豬偽狂犬病病毒gB蛋白ELISA抗體檢測(cè)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD630 nm值。試驗(yàn)成立的條件如下：陰性對(duì)照孔平均OD630 nm值-陽性對(duì)照孔平均OD630 nm值≥0.4。S=樣品孔OD630 nm值，N=陰性對(duì)照孔平均OD630 nm值，若S/N值≤0.6，樣品判定為抗體陽性;若S/N>0.7，樣品判定為抗體陰性;若0.6

（2）豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測(cè)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD630 nm值。試驗(yàn)成立的條件如下：陰性對(duì)照孔平均OD630 nm值-陽性對(duì)照孔平均OD630 nm 值≥0.3。S=樣品孔OD630 nm值，N=陰性對(duì)照孔平均OD630 nm值。若S/N值≤0.35，樣品判定為抗體陽性;若S/N>0.4，樣品判定為為抗體陰性;若0.35

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)前母豬體內(nèi)豬偽狂犬病病毒gB和gE抗體檢測(cè)結(jié)果 在母豬每個(gè)季度進(jìn)行普免后20 d，采集血樣進(jìn)行豬偽狂犬病病毒gB和gE抗體檢測(cè)。由表1可知，豬偽狂犬病病毒gB抗體全部為陽性，gE抗體全部為陰性。

2.2 免疫試驗(yàn)前仔豬體內(nèi)豬偽狂犬病病毒gB和gE抗體檢測(cè)結(jié)果 2016年9月在開展免疫試驗(yàn)前，對(duì)豬場(chǎng)10～60日齡仔豬進(jìn)行豬偽狂犬病病毒gB抗體和gE抗體抽檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gB抗體全部為陽性，gE抗體全部為陰性（表2）。

2.3 試驗(yàn)期間仔豬體內(nèi)豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)結(jié)果 對(duì)分組免疫試驗(yàn)仔豬，在免疫后每隔10 d進(jìn)行采血，檢測(cè)豬偽狂犬病gB抗體。由表3可知，在整個(gè)試驗(yàn)期，無論是用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫2次的試驗(yàn) Ⅰ 組與免疫3次的試驗(yàn) Ⅱ 組相比，還是用美國(guó)某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫2次的試驗(yàn)Ⅲ組與免疫3次的試驗(yàn)Ⅳ組相比，試驗(yàn)豬10、20、30、40、50、60、70日齡豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)豬80日齡，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異顯著（P<0.05）;試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅳ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異顯著（P<0.05）。試驗(yàn)豬90、100、115日齡時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異極顯著（P<0.01）;試驗(yàn)Ⅲ組與試驗(yàn)Ⅳ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異極顯著（P<0.01）。無論是用上海某生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗還是用美國(guó)某公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗進(jìn)行3次免疫的試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅳ組抗體可以維持較長(zhǎng)時(shí)間。

由表3還可知，整個(gè)試驗(yàn)期，試驗(yàn) Ⅰ 組與試驗(yàn)Ⅲ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異均不顯著（P>0.05），試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅳ組相比，豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值差異也不顯著（P>0.05）。

3 討論

豬偽狂犬病對(duì)世界各國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的危害是極大的，目前防控和根除豬偽狂犬病的主要措施還是免疫接種疫苗，不同規(guī)模生豬養(yǎng)殖場(chǎng)中主要應(yīng)用豬偽狂犬病疫苗進(jìn)行免疫[6]。自2011年以來，豬偽狂犬病在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)大范圍暴發(fā)，從華北、華中到華東、華南均有發(fā)生[7]，陰性豬場(chǎng)紛紛轉(zhuǎn)陽，給我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在豬偽狂犬病猖狂暴發(fā)的大環(huán)境下，除了需要選擇有保護(hù)力的疫苗外，制定合適的免疫程序也是豬只自身增強(qiáng)對(duì)病毒感染的抵抗力、防止病毒激活、減少病毒傳播率的關(guān)鍵所在。為了加強(qiáng)對(duì)豬偽狂犬病的防控力度，當(dāng)前大部分豬場(chǎng)普遍采用的是公豬、母豬4次普防，仔豬3次免疫的免疫程序。雷宇平等[8]曾報(bào)道2015年山西省母豬群野毒感染率達(dá)49.06%，處于相對(duì)較高水平，可見山西省豬偽狂犬病野毒感染普遍存在且比較嚴(yán)重，這對(duì)山西省生豬養(yǎng)殖行業(yè)的影響是不容低估的。筆者選用國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，在豬偽狂犬病陰性豬場(chǎng)對(duì)仔豬進(jìn)行2次或3次免疫，對(duì)比其免疫效果，以期為山西豬偽狂犬病的防控提供一種技術(shù)支持。

目前我國(guó)大部分生豬養(yǎng)殖場(chǎng)防控豬偽狂犬病主要使用gE 基因缺失活疫苗，因?yàn)槭褂眠@種疫苗可以通過血清學(xué)方法區(qū)分自然感染豬和免疫豬[9]。該試驗(yàn)選用國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗，公豬、母豬4次普防，在豬偽狂犬病陰性豬場(chǎng)對(duì)仔豬進(jìn)行2次或3次免疫，結(jié)果表明無論是用國(guó)產(chǎn)的還是進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗進(jìn)行免疫，試驗(yàn)豬前70日齡豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值各組間差異均不顯著（P>0.05）;80日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值顯著高于實(shí)行2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.05）;90、100、115日齡，實(shí)行3次免疫的試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值極顯著高于實(shí)行2次免疫的試驗(yàn)豬（P<0.01）。由此可見，公豬、母豬實(shí)行4次普防，仔豬3次免疫的免疫程序最佳。這與張敏等[10]研究的仔豬實(shí)行3次免疫的免疫程序在豬偽狂犬病陰性豬場(chǎng)能取得較好的免疫效果相一致。戴愛玲等[11]也認(rèn)為在臨床上加強(qiáng)疫苗免疫可以降低發(fā)病豬臨床癥狀的發(fā)生。

整個(gè)試驗(yàn)期，國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，進(jìn)口的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫后試驗(yàn)豬偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值高于國(guó)產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫后試驗(yàn)豬的偽狂犬病病毒gB抗體S/N平均值，但差異均不顯著（P>0.05），可見不論是進(jìn)口的還是國(guó)產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失活疫苗給豬免疫都可以產(chǎn)生良好的免疫效果，這與姚敬明等[12]的研究結(jié)果相一致，這些疫苗都可以推廣應(yīng)用。

豬偽狂犬病作為危害目前規(guī)模化豬場(chǎng)的主要傳染病之一，能引起種豬的繁殖障礙、仔豬的神經(jīng)癥狀及高死亡率以及生長(zhǎng)育肥豬的呼吸道病綜合征。盡管目前我國(guó)的免疫防控水平非常高，技術(shù)也十分成熟，但該病并沒有被徹底消滅，給養(yǎng)豬場(chǎng)帶來的經(jīng)濟(jì)損失仍然非常嚴(yán)重。根據(jù)我國(guó)《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020 年）》考核標(biāo)準(zhǔn)，2020 年全國(guó)所有種豬場(chǎng)達(dá)到豬偽狂犬病凈化標(biāo)準(zhǔn)。血清學(xué)調(diào)查是制訂凈化策略的基礎(chǔ)，因此加強(qiáng)免疫防控，定期進(jìn)行豬偽狂犬病病毒gB/gE抗體檢測(cè)，制定適合本場(chǎng)豬群的最佳免疫程序和凈化方案是防控豬偽狂犬病的根本措施。此外，還需要科技人員、豬場(chǎng)技術(shù)人員和管理人員共同不懈努力，爭(zhēng)取早日實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997：988-1009.

[2] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所.動(dòng)物傳染病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999：177-179.

[3] STRAW B E，ZIMMERMAN J J， ALLAIRE S D，等.豬病學(xué)[M]. 9版.趙德明，張仲秋，沈建忠，等譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008：465-480.

[4] 白文彬，于康震.動(dòng)物傳染病診斷學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[5] 張顯浩，陳瑞愛，李冰，等. 2012年-2013年我國(guó)集約化豬場(chǎng)豬偽狂犬病病毒感染情況的調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（3）：133-136.

[6] 邱美珍，李海輝，楊俊，等.豬偽狂犬病陽性場(chǎng)gE與gB抗體監(jiān)測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J].養(yǎng)豬，2014（6）：124-126.

[7] 劉吉山，李峰，姚春陽，等.豬偽狂犬病的流行特點(diǎn)與防控誤區(qū)[J].北方牧業(yè)，2015（15）：18-19.

[8] 雷宇平，寧艷，孫杰，等. 山西省豬偽狂犬病野毒感染血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫， 2015， 32（9）：1-3.

[9] 徐靈龍， 苗得園， 杜希珍， 等. 規(guī)?；i場(chǎng)母豬群PRV抗體的血清學(xué)調(diào)查[J].豬業(yè)科學(xué)， 2010，27（2）：72-74.

[10] 張敏，林巧芹，戴愛玲，等.相同免疫程序在豬偽狂犬病陽性場(chǎng)和陰性場(chǎng)免疫效果分析[J].福建畜牧獸醫(yī)， 2016，38（6）：20-22.

[11] 戴愛玲，范克偉，李曉華，等. 閩西南地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)豬偽狂犬野毒感染的血清流行病學(xué)調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016，43（1）：51-55.

[12] 姚敬明，王娟萍，韓一超，等. 豬偽狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（2）：184-186.