鄧詩貴，楊晨軍，馮加洲，吳曉玉

（江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，南昌市發(fā)酵應用技術重點實驗室，江西 南昌 330045）

木質素是植物細胞壁的重要組成部分，是一種非多糖高分子物質，在自然界中的產(chǎn)量僅次于纖維素[1]。木質素主要由愈創(chuàng)木基丙烷單元、紫丁香基丙烷單元和對羥基苯丙烷單元通過碳碳鍵和醚鍵聯(lián)接聚合而成[2]，分子量 600 kDa～1 500 kDa[3]。木質素主要存在于植物的木質結構中，使細胞壁硬化，增加細胞的剛性[4]。在植物細胞壁中，木質素和半纖維素之間相互作用形成牢固的結合層將纖維素包埋其中，由于木質素的非水溶性，使酶與纖維素不能良好接觸，限制了消化酶對細胞壁及細胞內(nèi)容物的分解功能[5]。木質素是所有天然有機產(chǎn)物中最難降解的物質[6]。

相關研究表明，木質素采用物理法、化學法處理時存在能耗高、“二次污染”等缺陷；而微生物降解木質素具有專一性強和無環(huán)境污染等特點，具有良好的應用前景[7]。自然環(huán)境下，木質素降解是由多種微生物共同作用的結果，降解能力由強到弱依次為真菌、放線菌和細菌。真菌中屬白腐菌對木質素降解能力最強，可以將木質素完全降解為CO2和H2O[8]。白腐菌在降解天然木質纖維素時，先降解半纖維素，以產(chǎn)生大量的碳源供菌絲生長，然后開始降解木質素，最后半纖維素、木質素和纖維素三者同時被降解[9]。

木質素高聚物在微生物產(chǎn)生的木質素降解酶作用下，斷裂結構單元間連接鍵，從而分解為低分子物質。木質素降解酶系主要包括漆酶（laccases，Lac）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase，Mnp）和木質素過氧化物酶（lignin peroxidase，Lip）。漆酶在降解木質素時，同時催化解聚和聚合反應；在Lip 或Mnp 等其他酶協(xié)同作用時，以抑制產(chǎn)物重新聚合，會提高木質素降解效率[10-11]。漆酶廣泛用于染料脫色，紙漿漂白以及畜牧業(yè)生產(chǎn)中。本研究從鐵皮石斛生長的樹皮中篩選到1 株產(chǎn)木質素降解酶的真菌——白黃小脆柄菇，并對其產(chǎn)漆酶條件進行優(yōu)化，為后續(xù)白腐菌漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基（g/L）：去皮馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂20；苯胺藍-PDA 培養(yǎng)基：滅菌后添加用無菌過濾器加入0.1 g/L 苯胺藍[12]；愈創(chuàng)木酚-PDA 培養(yǎng)基：滅菌加入0.4%的愈創(chuàng)木酚[13]；初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：去皮馬鈴薯 200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，KH2PO41，酒石酸銨0.02，CuSO40.01，MgSO40.3，MnSO40.03。

1.1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖、蛋白胨、乙酸、乙酸鈉、酒石酸銨、KH2PO4、MnSO4、CuSO4、MgSO4：西隴化工股份有限公司，以上化學試劑皆為分析純；ABTS：aladdin 公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑及擴增引物：湖南擎科生物技術有限公司；SW-CJ-1D 型超凈作臺：江蘇蘇潔凈化設備廠；SKY-2112B 型恒溫雙層搖床：上海蘇坤儀器儀表有限公司。

1.2 菌種分離

取1 g 鐵皮石斛生長的腐木用研缽研碎，加入9 mL的無菌水稀釋，放入200 r/min 的振蕩器中振蕩1 h，制成10-1腐木懸液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，依次10 倍遞增系列稀釋至10-6，每個梯度的樣品取100 μL 接種到苯胺藍-PDA 培養(yǎng)基上，置于 30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d，后挑取在苯胺藍-PDA 平板上有退色變化的單一菌種再接種到愈創(chuàng)木酚-PDA 培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)基中苯胺藍和愈創(chuàng)木酚分別可以檢測過氧化物酶和漆酶的產(chǎn)生與否，通過兩種培養(yǎng)基可以得到同時產(chǎn)過氧化物酶和漆酶的菌株。

1.3 菌種的鑒定

在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)選出的單一菌株轉接至PDA 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d～7 d，挑取菌絲在顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)。

挑取篩選出的菌株的菌絲采用CTAB 法提取總DNA，采用真菌通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR 反應體系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，ITS1（10 μmol/L）2μL，ITS4 （10 μmol/L）2 μL，Template 1 μL，ddH2O 20 μL。反應條件：①98 ℃，2 min，②98 ℃，10 s，54 ℃，10 s，72 ℃，10 s，35 個循環(huán)，③72 ℃，5 min。引物合成和 PCR 擴增產(chǎn)物測序由湖南擎科生物技術有限公司完成。菌株序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫序列進行相似性分析，并加入Phanerochaete chrysosporium （黃孢原毛平革菌——白腐真菌中對木質素降解研究最透徹的模式菌株[8，14]）的rDNA-ITS 基因序列作為外參，并用MEGA 6.06 軟件包中 Neighbor-joining （kimura'2-parameter modle，bootstrap 1000）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株液體發(fā)酵

保藏于PDA 斜面的菌株SHIHU-X2，經(jīng)新制的PDA 培養(yǎng)基平板上活化，28 ℃下培養(yǎng)7 d，在菌株活化后的平板上用無菌打孔器制造出直徑為5 mm×5 mm菌塞塊，將10 個菌塊轉接到50 mL 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（250 mL 三角瓶），30 ℃搖床培養(yǎng) 5 d，5 000 r/min，離心10 min 取上清液測定木質素降解酶活力。

1.5 木質素降解酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

對初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液Mnp、Lip 和Lac 進行測定，比較3 種木質素降解酶活的大小，確定以漆酶產(chǎn)量為評價指標來優(yōu)化SHIHU-X2 產(chǎn)木質素降解酶培養(yǎng)基。

1.5.1 Plackett-Burman 試驗設計

Plackett-Burman 試驗可以快速地從眾多的因素中有效地確定最主要的幾個因素，供進一步研究[15]。分別從蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、酒石酸銨 CuSO46 個因素中篩選出對菌株SHIHU-X2 產(chǎn)漆酶影響最重要的幾個因素。采用Design-Expert 8.0.5 設計試驗，進行N=12 次試驗，其中添加5 組為虛擬變量，以漆酶產(chǎn)量為評價指標。試驗設計見表1。

表1 Plackett-Burman 設計因子水平及編碼Table 1 The two levels of variables used in the Plackett-Burman design

1.5.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman 試驗結果得到3 個對白黃小脆柄菇產(chǎn)Lac 關鍵因素為蛋白胨、MgSO4和MnSO4，KH2PO4、酒石酸銨和CuSO4取初始濃度，然后按梯度減少蛋白胨的濃度，并按梯度增加MgSO4和MnSO4的濃度，測定發(fā)酵液的Lac 活力的變化，從而確定此3個因素的最適濃度范圍。

1.5.3 Box-Behnken 設計

以Plackett-Burman 試驗篩選得到的對發(fā)酵液的Lac 影響顯著的因素作為設計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，根據(jù)表2進行試驗，進行三因素三水平，共17 個試驗組響應面試驗設計，以發(fā)酵液的漆酶產(chǎn)量為響應值。

表2 Box-Behnken 設計水平表Table 2 Levels of variables used in the Box-Behnken design

1.6 酶活的測定

取1 mL 發(fā)酵液用蒸餾水稀釋10 倍后測定其木質素降解酶活力，以沸水浴30 min 的酶液作空白對照。木質素過氧化物酶（Lip）活力測定用黎蘆醇法[16]，錳過氧化物酶（Mnp）活力測定用 MnSO4法[17]，漆酶（Lac）活力測定用ABTS 法[18]。酶活力定義為每分鐘氧化1 μmol底物所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

酶活的計算方法：酶活力（U/mL）=（ΔOD×106×n×10-3）/（Δt×ξ）。式中：n 為發(fā)酵液稀釋倍數(shù)；ΔOD 為吸光度變化；106為將 mol 換算成 μmol 的系數(shù)；Δt 為反應時間，min；ξ 為摩爾消光數(shù)，L/（M·cm）；ABTS 氧化產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)為3.6×104L/（M·cm），三價錳離子的摩爾吸光系數(shù)為8.1×103L/（M·cm），藜蘆醛的摩爾吸光系數(shù)9.3×103L/（M·cm）。

2 結果與分析

2.1 木質纖維素降解菌的篩選結果

苯胺藍脫色法對檢測降解木質素的過氧化物酶類專一性強，能有效的檢測出木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶等過氧化物類型酶[19]。愈創(chuàng)木酚定性的測定菌株是否能降解木質素具有漆酶活性的菌株，可在菌落周圍形成鮮艷而均勻的紅棕色氧化圈，氧化圈的大小和顏色的深淺可以很好地反映出漆酶的活性大小[20-21]。菌株SHI-X2 在苯胺藍-PDA 平板上的退色和愈創(chuàng)木酚-PDA 平板顯色反應見圖1。

圖1 苯胺藍-PDA 平板褪色反應和愈創(chuàng)木酚-PDA 平板顯色反應圖Fig.1 Fading reaction on aniline blue-PDA plates and color reaction on guaiacol-PDA plates

由圖1可知，愈創(chuàng)木酚對SHI-X2 有一定的抑制作用，在愈創(chuàng)木酚-PDA 平板上生長緩慢，但紅棕色圏比菌落大很多，說明可以產(chǎn)漆酶能力較強；在苯胺藍-PDA 平板生長正常，裸色圈直徑大于菌落直徑，說明具有良好的產(chǎn)降解木質素過氧化物酶的能力。

2.2 SHIHU-X2的鑒定

顯微鏡觀察菌絲狀況如圖2所示。

圖2 SHIHU-X2 的菌絲Fig.2 The mycelium of SHIHU-X2

SHIHU-X2 形態(tài)結構觀察：菌株SHIHU-X2 在培養(yǎng)的過程，菌落中心突起，菌絲呈白色。

將菌株ITS1～ITS4 序列測定結果與2018年4月的NCBI 中數(shù)據(jù)庫進行BLASTn 序列比對分析，選取結果中相似度最高的菌屬作為對應菌株分類標準，繪制系統(tǒng)進化樹，見圖3。

圖3 菌株SHIHU-X2 基于ITS1～ITS4 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic position based on ITS1-ITS4 sequences of strain SHIHU-X2

利用MEGA 6.06 構建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株SHIHU-X2 的 ITS1～ITS4 序列基因序列與 Psathyrella屬的菌株rDNA-ITS 基因序列相似度為99%，與登入號MF401519.1 的白黃小脆柄菇菌親緣關系最為相近，Bootstrap 支持率達到93%。因此將該菌株SHIHUX2 初步鑒定為白黃小脆柄菇。

2.3 液體發(fā)酵液酶活結果

測定初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液的3 種木質素降解酶 Mnp、Lip 和 Lac，結果發(fā)現(xiàn) Mnp、Lip 的酶活為2.47×10-3U/mL，1.86×10-3U/mL，Lac 的酶活是 1.11 U/mL，與傅愷[22]的研究類似，白黃小脆柄菇的Mnp、Lip 產(chǎn)量較小，Lac 產(chǎn)量較大，所以將以Lac 為指標優(yōu)化SHIHUX2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

2.4 Plackett-Burman試驗設計結果與分析

Plackett-Burman 試驗設計結果見表3，采用Design-Expert 8.05 軟件對表3中的Lac 產(chǎn)量數(shù)據(jù)進行回歸分析，見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗設計與結果Table 3 Plackett-Burman experiment design and response values

表4 Plackett-Burman 試驗顯著性方差分析Table 4 Analvsis of variance of the Plackett-Burman tests

由表4可知，在白黃小脆柄菇產(chǎn)Lac 的過程中，在a=0.10 的顯著水平上，蛋白胨、MgSO4和MnSO4對 Lac產(chǎn)量影響顯著。其中MgSO4和MnSO4的濃度對產(chǎn)Lac是正效應，蛋白胨為負效應，因此將KH2PO4、酒石酸銨和CuSO4取低水平，以蛋白胨、MgSO4和MnSO4作為主要因素進一步做優(yōu)化試驗。

2.5 爬坡試驗設計與結果

最陡爬坡試驗設計及其結果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計及其結果Table 5 Steepest ascent path design and results

如表5所示，隨著蛋白胨、MgSO4和MnSO4濃度的變化，發(fā)酵液的Lac 酶活先升后降，當?shù)鞍纂?、MgSO4和 MnSO4濃度分別為 1.25、0.55 g/L 和 0.055 g/L 時，發(fā)酵液的Lac 酶活達到最大值，以此濃度作為中心點，進行下一步響應面優(yōu)化試驗。

2.6 響應面優(yōu)化試驗

2.6.1 Box-Behnken 試驗結果

以蛋白胨、MgSO4和MnSO43 個重要因素為自變量，采用Box-Behnken 試驗設計對產(chǎn)Lac 的發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，設計了17 個試驗組，各因素水平選擇以及結果見表6。

表6 BOX-Behnken 試驗設計和結果Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken tests

2.6.2 模型的建立與顯著性檢驗

利用Design Expert 8.05 軟件分析Box-Behnken試驗結果，通過對數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到自變量與粗纖維降解率（Y）對得到二次多項式方程：Y=2.21－0.032A＋0.14B＋0.16C－0.025AB＋0.040AC＋0.028BC－0.21A2－0.28B2－0.17C2，此模型的方差分析見表7。

表7 模型回歸方程方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equations

2.6.3 響應面分析

圖4～圖6是由響應值和試驗因素構成間的三維響應面圖，顯示了蛋白胨、MgSO4和MnSO4中任意1 個變量取零水平時，其余兩個變量對漆酶活力的影響。

圖4 蛋白胨與MgSO4 對漆酶產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of peptone and MgSO4 on laccase production

由圖4可知，在試驗水平范圍內(nèi)，當?shù)鞍纂藶槟骋欢ㄖ禃r，隨著MgSO4的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化范圍較大，特別是在到達0 點之前上升趨勢明顯，超過0 點之后下降較緩；當MgSO4濃度一定時，隨著蛋白胨的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化范圍較小，結合等高線的疏密程度，說明MgSO4比蛋白胨對漆酶活力的影響更顯著。

圖5 蛋白胨與MnSO4 對漆酶產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of peptone and MnSO4 on laccase production

由圖5可知，在試驗水平范圍內(nèi)，當?shù)鞍纂藶槟骋欢ㄖ禃r，隨著MnSO4的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，上升時坡度較大，下降時坡度較緩；當MgSO4濃度一定時，隨著蛋白胨的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化范圍較小，結合等高線的疏密程度，說明MgSO4比蛋白胨對漆酶活力的影響更顯著。

圖6 MgSO4 與MnSO4 對漆酶產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of MgSO4 and MnSO4 on laccase production

由圖6可知，在試驗水平范圍內(nèi)，當MgSO4為某一定值時，隨著MnSO4的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，且上升趨勢明顯；當MnSO4濃度一定時，隨著MgSO4濃度的的增大，漆酶活力呈現(xiàn)先上升后下降，變化的趨勢更緩慢，結合等高線的疏密度，說明MnSO4的主效應大于MgSO4。

2.6.4 最佳培養(yǎng)基的確定及驗證試驗

通過Design-Expert 軟件對回歸方程求解得到模型最大值，即蛋白胨1.24 g/L，MgSO40.56 g/L，MnSO40.057 g/L，此時發(fā)酵液的漆酶活力最大值為2.27 U/mL。

在預測最佳培養(yǎng)基配方條件下進行發(fā)酵試驗，做3 個重復，所得的實際發(fā)酵液漆酶活力為2.32 U/mL，與預測值2.27 U/mL 接近，說明該模型能較好的預測實際發(fā)酵情況。

3 結論與討論

采用苯胺藍-PDA 平板法和愈創(chuàng)木酚-PDA 平板法從從鐵皮石斛生長的樹皮中篩選到菌株SHIHUX2，經(jīng)ITS 測序分析將SHIHU-X2 鑒定為白黃小脆柄菇。采用Plackett-Burman 法從6 個因素中篩選對SHIHU-2 產(chǎn)漆酶影響最重要因素，結果表明，蛋白胨、MgSO4、MnSO4和對白黃小脆柄菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶活力影響較大。在此基礎上，用最陡爬坡試驗及Box-Behnken 設計進一步優(yōu)化，利用Design-Expert 軟件進行二次回歸分析，得到各因素的最佳濃度為蛋白胨1.24 g/L，MgSO40.56 g/L，MnSO40.057 g/L，在此條件下實際發(fā)酵液漆酶活力可達到2.32 U/mL，所得值與模型預測值2.27 U/mL 相接近，較初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的漆酶活力提高了109%。

傅愷[22]以去皮馬鈴薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO43 g/L 為培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)白黃小脆柄菇，其野生菌株培養(yǎng)至第6 天漆酶活力達高峰1.48 U/mL；經(jīng)紫外誘變選育到的漆酶高產(chǎn)誘變菌株U10-11 培養(yǎng)至第3 天時漆酶活力高峰4.63 U/mL。張麗等[23]以去皮馬鈴薯 300 g/L，葡萄糖 20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO43 g/L 為培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)白黃小脆柄菇，培養(yǎng)至第3天漆酶活力達高峰31 525 IU/L。白腐菌白黃小脆柄菇可以產(chǎn)生少量錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶，尤其是產(chǎn)漆酶潛力巨大，若通過基因工程等手段選育出漆酶高產(chǎn)的工程菌株，則有望應用到漆酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。