張逸舒，王玉榮，陳蕓曼，張傲然，張振東，郭壯

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽(yáng) 441053）

保康縣位于秦巴山區(qū)深處，隸屬湖北省襄陽(yáng)市，西連神龍架，北交武當(dāng)山，境內(nèi)山巒重疊森林覆蓋率達(dá)66.8%，生活著漢族、畬族、回族和土家族等多個(gè)民族[1]。特殊的地理環(huán)境及多民族雜居的現(xiàn)狀賦予了其獨(dú)特的飲食文化，?？档貐^(qū)居民歷來(lái)有制作和食用鲊廣椒、臭豇豆、臭豆渣和臭醬巴的習(xí)俗。保康地區(qū)鲊廣椒以鮮紅辣椒和苞谷面（玉米磣）為主要原料，采用厭氧發(fā)酵制作而成，具有酸辣可口和味道鮮香的特點(diǎn)，常作為輔料用于臘肉、雞蛋和魚(yú)類(lèi)的烹飪中。傳統(tǒng)發(fā)酵食品的風(fēng)味品質(zhì)與其微生物多樣性息息相關(guān)，而發(fā)酵食品制作地的生態(tài)環(huán)境在很大程度上影響了其蘊(yùn)含的微生物群系[2]。曾有研究對(duì)湖北當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒的微生物多樣性進(jìn)行解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鲊廣椒中的細(xì)菌主要以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為主[3-4]。然而目前關(guān)于?？档貐^(qū)鲊廣椒乳酸菌多樣性研究的報(bào)道尚少。

作為現(xiàn)代食品加工業(yè)常用的發(fā)酵劑，乳酸菌廣泛存在于泡菜[5]、發(fā)酵肉制品[6]、發(fā)酵乳制品[7]、發(fā)酵酒[8]和人體腸道[9]中，長(zhǎng)期食用乳酸益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群[10]和改善代謝綜合癥[11]的功效。鲊廣椒的發(fā)酵原料為蔬菜和淀粉質(zhì)食材，發(fā)酵方式為厭氧固態(tài)發(fā)酵，制作方法亦與酸奶、泡菜及臘肉制品均存在較大的差異，因而其乳酸菌群系可能存在一定的特殊性，所以在解析乳酸菌多樣性的基礎(chǔ)上開(kāi)展菌株收集工作具有積極的意義。在實(shí)地調(diào)研過(guò)程中，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)鲊廣椒雖然廣泛分布于我國(guó)云南、四川、重慶、湖北、湖南和貴州等華中和西南地區(qū)，但其產(chǎn)業(yè)化程度較低，多以百姓自制為主，且制作的鲊廣椒產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)相對(duì)較差，存在輕微臭味等產(chǎn)品缺陷問(wèn)題。由此可見(jiàn)，積極開(kāi)展具有優(yōu)良發(fā)酵特性鲊廣椒來(lái)源乳酸菌的篩選，以乳酸菌純種發(fā)酵代替自然發(fā)酵，對(duì)鲊廣椒風(fēng)味品質(zhì)和食用安全性的提升均具有積極意義。

本研究采用純培養(yǎng)和16S rRNA 鑒定技術(shù)對(duì)7 份采集自保康地區(qū)的鲊廣椒中乳酸菌多樣性進(jìn)行了解析，在對(duì)其乳酸菌分離株進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，采用電子鼻和電子舌從風(fēng)味和滋味兩個(gè)維度對(duì)具有優(yōu)良發(fā)酵特性的菌株進(jìn)行篩選，以期對(duì)后續(xù)鲊廣椒風(fēng)味品質(zhì)的提升提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米磣和二荊條紅辣椒：市購(gòu)；石蕊牛乳培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、碳酸鈣、甘油、草酸銨結(jié)晶紫、碘、95 %乙醇、番紅、過(guò)氧化氫、磷酸二氫鉀、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、氯仿、異戊醇、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecy1 trimethylammonium bromide，CTAB）（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；10×PCR Buffer、dNTP、Taq酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：西班牙Biowest 公司；27F、1495R 通用引物：武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司；陰離子溶液、陽(yáng)離子溶液：日本INSENT 公司；草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YL90-2 磨面機(jī)：上海捷朗機(jī)電有限公司；BS224S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ECLIPSE Ci 生物顯微鏡：日本Nikon 公司；XFS-280 手提式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；DG250 厭氧工作站：英國(guó)Don Whitley 公司；vetiri 梯度基因擴(kuò)增儀：美國(guó)AB 公司；UVPCDS8000 凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)ProteinSimple 公司；LRH-150 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PGJ-10-AS 純水儀：武漢品冠儀器設(shè)備有限公司；DYY-12 電泳儀：北京六一儀器廠；SA402B 味覺(jué)分析系統(tǒng)：日本Insent 公司；PEN3 便攜式電子鼻：德國(guó)Airsense 公司；LC-20ADXR 高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

每份鲊廣椒樣品取5 g 于150 mL 石蕊牛乳培養(yǎng)基中 37 ℃增殖培養(yǎng) 24 h 后，選 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66 個(gè)梯度進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)^而用移液器吸取200 μL各梯度稀釋液分別涂布于含有碳酸鈣的MRS 固體培養(yǎng)基上，并于厭氧工作站中37 ℃培養(yǎng)48 h，厭氧工作站通入體積比為85 ∶10 ∶5 的氮?dú)?、氫氣和二氧化碳混合氣體[12]。挑選平板上有溶解圈且形態(tài)、大小和顏色等均不相同的菌落進(jìn)行2 次劃線，并將得到的單一菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，選擇革蘭氏陽(yáng)性和過(guò)氧氫酶陰性的菌株定義為疑似乳酸菌菌株，并用甘油管冷凍保藏法保藏后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳酸菌基因組DNA 提取、16S rRNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增和菌株鑒定

使用CTAB 法進(jìn)行DNA 提取[13]，提取后的DNA樣品置-20 ℃暫存?zhèn)溆?。以此DNA 為模板，利用PCR 擴(kuò)增其 16S rRNA 基因片斷。PCR 擴(kuò)增體系（50 μL）的配制：27F 和 1495R 各 1 μL、模板 1 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Taq 酶 0.4 μL，最后加無(wú)菌超純水37.6 μL 至 50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃變性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min30 s 循環(huán) 30 次，72 ℃延伸 10 min，4 ℃保溫[12]。

取上述PCR 產(chǎn)物2.5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠的濃度為1%，電泳后染色觀察，用凝膠成像儀照相。將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物用PCR 清潔試劑盒清潔，清潔后PCR 產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后送武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司測(cè)序。序列測(cè)序結(jié)束后用DNAMAN 對(duì)序列結(jié)果進(jìn)行拼接及引物序列校準(zhǔn)，然后用于同源性比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。所得序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST（Basic Local Alignment SearchTool）同源性比對(duì)，以同源性大于等于99%為分界閾值鑒定待測(cè)菌株[14]，將菌株序列提交至GeneBank，獲得登錄號(hào)（MH656804-MH656824）。利用 MEGA7 與模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化親緣關(guān)系研究并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

此外，人們還會(huì)受到氣候、就業(yè)和稅率等因素的影響，那些在城市中沒(méi)有比較穩(wěn)定家庭的人往往對(duì)這些因素的反應(yīng)會(huì)更為劇烈。選擇住在農(nóng)村和城郊地區(qū)居住的人們發(fā)現(xiàn)農(nóng)村和城郊地區(qū)空氣更清新、環(huán)境更安靜、生活空間更大，有益于自身的身心健康。而且隨著信息化的發(fā)展，較小的城鎮(zhèn)也有方便的購(gòu)物渠道以及便捷的信息獲取方式。

1.3.3 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒樣品的制備

取750 g 玉米磣、225 g 切碎的二荊條紅辣椒（保留其汁液和水分）、3.15 g 花椒粉、3.15 g 胡椒粉、75 g食鹽混合均勻備用。1.3.2 中分離鑒定的13 株植物乳桿菌使用MRS 液體培養(yǎng)基活化3 代，離心收集菌體，用50 mL 生理鹽水懸浮后，按照5×106/g 原料的比例接入混合均勻的鲊廣椒原料中，同時(shí)以不添加乳酸菌的樣品作為對(duì)照。將2 L 玻璃泡菜壇壇口擦拭干凈，使用噴壺于壇口噴灑3 mL 白酒，蓋蓋后自來(lái)水封口，30 ℃發(fā)酵21 d，樣品備用。

1.3.4 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒風(fēng)味、滋味和有機(jī)酸構(gòu)成的評(píng)價(jià)

將10 g 鲊廣椒置于樣品瓶中，60 ℃保溫20 min 后室溫25 ℃平衡10 min。參照楊成聰?shù)萚15]的方法，使用PEN3 便攜式電子鼻對(duì)其風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

將50 g 鲊廣椒加入150 mL 去離子水浸泡30 min后，12 000 r/min 離心10 min 取上清，上清液置于100 mL量筒中4 ℃過(guò)夜，取中間無(wú)油脂和殘?jiān)某吻逡后w備用。參照王玉榮等[16]的方法，使用SA402B 味覺(jué)分析系統(tǒng)對(duì)其酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味A、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。

將 20.00 g 鲊廣椒至 100 mL 容量瓶中，用0.01 mol/L 的磷酸二氫鉀溶液定容后浸泡30 min，浸泡液 12 000 r/min 離心 10 min 取上清液過(guò) 0.45 μm 濾膜，濾液備用。參照楊成聰?shù)萚17]的方法，使用高效液相色譜法對(duì)其乳酸、乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

基于電子鼻和電子舌數(shù)據(jù)矩陣，使用主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用SAS9.0 軟件PCA，使用Origin 2017 軟件繪圖，使用Mega7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?？档貐^(qū)鲊廣椒中乳酸菌的分離鑒定

本研究共從湖北?？档貐^(qū)采集以玉米和二荊條辣椒為原料制作的鲊廣椒樣品7 份，采用純培養(yǎng)技術(shù)共分離出20 株疑似乳酸菌，在對(duì)其基因組DNA 進(jìn)行提取的基礎(chǔ)上，以16S rRNA 基因全長(zhǎng)序列為靶點(diǎn)進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增，使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 16S rRNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of PCR amplification products of 16S rDNA

由圖1可知，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，20 條泳道中PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一且明顯，長(zhǎng)度約在1 500 bp。由此可見(jiàn)，PCR 無(wú)非特異性擴(kuò)增，且擴(kuò)增產(chǎn)物濃度較高，符合后續(xù)清潔、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定的需要。

將測(cè)序反饋回的序列信息進(jìn)行比對(duì)后，與同源性比對(duì)結(jié)果≥99%的模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果如圖2所示。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree

由圖2可知，分離出的20 株疑似乳酸菌被鑒定為4 個(gè)種，其中菌株HBUAS52326 和HBUAS52338 與模式株Lactobacillus brevis JCM1059 位于1 個(gè)分支上，因而鑒定為短乳桿菌（L.brevis）；菌株 HBUAS52335 和HBUAS52334 與模式株 L.alimentarius DSM20249 位于1 個(gè)分支上，因而鑒定為食品乳桿菌（L.alimentarius）；菌株HBUAS52341 與模式株L.crustorum R-27957 位于1 個(gè)分支上，因而鑒定為面包乳桿菌（L.crustorum）；其他15 株乳酸菌均與模式株L.plantarum JCM1149 位于1 個(gè)分支上，因而鑒定為植物乳桿菌（L.plantarum）。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌為保康地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，占分離株總數(shù)的75.0%。值得一提的是，所有菌株與模式株的同源性均為100%，因而本研究的鑒定結(jié)果具有較高的可靠性。

2.2 植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

在對(duì)保康地區(qū)鲊廣椒中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，本研究擬進(jìn)一步評(píng)價(jià)植物乳桿菌純種發(fā)酵對(duì)鲊廣椒品質(zhì)的影響。由于L.plantarum HBUAS52330 和L.plantarum HBUAS52331 在MRS 液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，因而選取了其他13 株植物乳桿菌進(jìn)行了鲊廣椒的制備。電子鼻各傳感器對(duì)不同處理鲊廣椒響應(yīng)值的差異性分析如表1所示。

表1 電子鼻各傳感器對(duì)不同處理鲊廣椒響應(yīng)值的差異性分析Table 1 Difference analysis of response value of Zhaguangjiao samples with different treatment by electronic nose

續(xù)表1 電子鼻各傳感器對(duì)不同處理鲊廣椒響應(yīng)值的差異性分析Continue table 1 Difference analysis of response value of Zhaguangjiao samples with different treatment by electronic nose

由表1數(shù)據(jù)可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵的多數(shù)鲊廣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中芳香類(lèi)物質(zhì)和烷烴類(lèi)物質(zhì)明顯增多，而氫氧化物、甲烷、乙醇和有機(jī)硫化物含量明顯下降。因芳香類(lèi)物質(zhì)為鲊廣椒特征性風(fēng)味指標(biāo)的重要組成部分，而乙醇和有機(jī)硫化物為缺陷型指標(biāo)的組成部分，因而多數(shù)植物乳桿菌進(jìn)行純種發(fā)酵可明顯提升鲊廣椒的風(fēng)味品質(zhì)。

2.3 植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒滋味品質(zhì)的評(píng)價(jià)

在使用電子鼻對(duì)植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)的同時(shí)，進(jìn)一步使用電子舌對(duì)其滋味品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)，將自然發(fā)酵的鲊廣椒各滋味品質(zhì)均設(shè)置為0，各植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒樣品減去自然發(fā)酵鲊廣椒各滋味指標(biāo)的原始強(qiáng)度值即為其相對(duì)強(qiáng)度值。植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的箱形圖如圖3所示。

圖3 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的箱形圖Fig.3 Box plot of response value of Zhaguangjiao samples fermented by L.plantarum with electronic tongue

由圖3可知，鲊廣椒樣品在澀味、酸味和鮮味3 個(gè)指標(biāo)上的差異性較大，其極差值分別為3.36、3.26 和2.88；其次為咸味、苦味和豐度（鮮味的回味），極差值分別為2.10、1.81 和1.00；而在后味B（苦味的回味）和后味A（澀味的回味）2 個(gè)指標(biāo)上的差異較小，極差值僅為0.94 和0.75。由圖3亦可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的鲊廣椒酸味、咸味、鮮味和豐度（鮮味的回味）相對(duì)強(qiáng)度明顯高于自然發(fā)酵，而多數(shù)樣品的苦味和澀味呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。

由于酸味和鮮味為鲊廣椒的特征性指標(biāo)，而苦味和澀味為缺陷型指標(biāo)，因而采用植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒可明顯提升產(chǎn)品的滋味品質(zhì)。本研究進(jìn)一步采用高效液相色譜法對(duì)鲊廣椒中有機(jī)酸的種類(lèi)和含量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 植物乳桿菌純種發(fā)酵鲊廣椒各有機(jī)酸含量的箱形圖Fig.4 The box plot of content of organic acids in Zhaguangjiao samples fermented by L.plantarum

由圖4可知，乳酸和乙酸為鲊廣椒中的主要有機(jī)酸，本研究制備的14 個(gè)鲊廣椒樣品中其平均含量分別為2.58 mg/g 和1.44 mg/g；其次為草酸、酒石酸和琥珀酸，平均相對(duì)含量分別為1.24、1.05 mg/g 和0.77 mg/g；雖然含有蘋(píng)果酸和檸檬酸，但平均相對(duì)含量?jī)H為0.39 mg/g 和0.37 mg/g。由圖4亦可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的鲊廣椒中乳酸和酒石酸含量明顯偏高，這可能是導(dǎo)致鲊廣椒樣品酸味升高的主要原因。

2.4 基于PCA植物乳桿菌純種發(fā)酵制備鲊廣椒品質(zhì)的評(píng)價(jià)

進(jìn)一步采用PCA 以電子鼻和電子舌的18 個(gè)指標(biāo)為參數(shù)，采用因子載荷圖對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行了分類(lèi)，同時(shí)采用因子得分圖對(duì)不同處理鲊廣椒樣品進(jìn)行了空間排布。因子載荷圖如圖5所示。

圖5 基于PCA 的PC1 和PC2 因子載荷圖Fig.5 Factor loading diagram of PC1 and PC2 based on PCA

由圖5可知，第一主成分（principal component 1，PC1）與PC2 的貢獻(xiàn)率分別為48.19%和19.96%，在進(jìn)行PCA 時(shí)若主成分貢獻(xiàn)率越大則表示該主成分反映原有多指標(biāo)的信息越全面[18]。由此可見(jiàn)，僅采用PC1 和PC2 信息即可反映本研究近70%的數(shù)據(jù)信息，因而本研究的分析結(jié)果相對(duì)可靠。由圖5亦可知，PC1 主要由W1C、W3C、W5C、W1W、W5S、W2W、W1S 和 W2S 構(gòu)成，且 W1C、W3C、W5C 這 3 個(gè)對(duì)芳香類(lèi)物質(zhì)敏感的傳感器均位于X 軸負(fù)方向；PC2 主要由酸味、苦味、澀味和后味B（苦味的回味）構(gòu)成，且鲊廣椒的特征性風(fēng)味物質(zhì)酸味主要位于Y 軸負(fù)方向。由此可見(jiàn)，PC1 主要由風(fēng)味指標(biāo)構(gòu)成，PC2 主要由滋味指標(biāo)構(gòu)成，且在因子得分圖中空間排布越偏向左下方的鲊廣椒樣品其品質(zhì)越好。因子得分圖如圖6所示。

圖6 基于PCA 的PC1 和PC2 因子得分圖Fig.6 Factor scores diagram of PC1 and PC2 based on PCA

由圖6可知，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的多數(shù)鲊廣椒樣品空間排布較之對(duì)照組偏向左下方，因而多數(shù)植物乳桿菌進(jìn)行純種發(fā)酵可明顯提升鲊廣椒的品質(zhì)。較之其他菌株，L.plantarum HBUAS52332 制備的鲊廣椒雖然風(fēng)味品質(zhì)一般，但其酸味較為濃郁，L.plantarum HBUAS52327 制備的鲊廣椒風(fēng)味和滋味品質(zhì)均較佳。由此可見(jiàn)，L.plantarum HBUAS52327 和L.plantarum HBUAS52332 可進(jìn)一步用于后續(xù)具有優(yōu)良鲊廣椒發(fā)酵特性菌株的篩選。

3 結(jié)論

植物乳桿菌為?？档貐^(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，多數(shù)植物乳桿菌菌株進(jìn)行純種發(fā)酵可明顯提升鲊廣椒的風(fēng)味和滋味品質(zhì)。乳酸和乙酸為鲊廣椒中的主要有機(jī)酸，植物乳桿菌純種發(fā)酵制備的鲊廣椒中乳酸和酒石酸含量明顯偏高。L.plantarum HBUAS52327 和L.plantarum HBUAS52332 純種發(fā)酵制備的鲊廣椒樣品具有較好的品質(zhì)，可進(jìn)一步用于后續(xù)具有優(yōu)良鲊廣椒發(fā)酵特性乳酸菌菌株的篩選。