郝元元

（烏蘭察布職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000）

柚[Citrus maxima（Burm）Merr.]為蕓香科柑橘屬喬木，在東南亞各國以及我國長江以南各地均有栽培，且品種繁多，因柚子果肉口感酸甜，富含維生素C，具有消食、理氣、解酒毒等功效而深受人們喜愛[1-3]，但柚經(jīng)食用或加工后每年都生產(chǎn)大量的柚子皮，除部分柚子皮被制成藥材，大部分柚子皮被丟棄，既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境。目前國內(nèi)外科學(xué)工作者已報(bào)道柚子皮中含有活性多糖、黃酮類化合物、膳食纖維、柚子皮黃色素、柚子皮精油、果膠、柚皮苷等功效成分[4-9]。而蕓香科柑橘屬植物廣泛含有香豆素及其衍生物，即一類具有芳香性氣味的物質(zhì)，結(jié)構(gòu)類型多樣，具有多種活性，是醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料等精細(xì)化工產(chǎn)品的原料和中間體[10-14]。古淑儀等[11]采用X 射線單晶衍射儀測(cè)定化州柚未成熟干燥幼果中3 個(gè)7-甲氧基香豆素；胡甜恬等[12]采用多種色譜層析分離純化，經(jīng)波譜分析新鮮沙田柚皮的95 %乙醇提取物中分離得到10 個(gè)香豆素類化合物；王輝等[13]采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定沙田柚果肉汁中6 種呋喃香豆素類化合物，而關(guān)于柚子皮中香豆素及其衍生物的研究報(bào)道較少[14-15]。本研究采用堿性甲醇超聲萃取香豆素及其衍生物，經(jīng)C18柱分離，采用液相色譜－質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）對(duì)柚子皮中8 種香豆素及其衍生物含量進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，為農(nóng)業(yè)廢棄物柚子皮的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、材料

Waters ACQUITY Xevo TQ MS 型高效液相色譜儀-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：美國Waters 公司；BS224S 型電子天平：德國Sartorius 公司MM400 型研磨儀：德國RETSCH 公司；MixPlus 渦旋混合儀：合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；YQ-1000C 型超聲波清洗器：上海易凈超聲波儀器有限公司；Rotavapor R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI 公司；ULUP-Ⅱ型超純水機(jī)：西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司。

8 種香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6－甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、環(huán)香豆素、醋硝香豆素、雙香豆素：純度均≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司，具體信息見表1；甲酸、乙酸銨：均為色譜純，美國Sigma 公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷：均為色譜純，美國Tedia 公司；其余試劑均為分析純：西隴化工股份有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

表1 香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息Table 1 Standard substance information of coumarin and its derivatives

香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10.0 mg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取香豆素及其衍生物0.1 g（精度至0.1 mg），用少量甲醇溶解后定容至10 mL 容量瓶中，-20 ℃保存。

6 份不同產(chǎn)地的柚子，產(chǎn)地分別為廣東梅州（沙田柚）、廣東化州（化州柚）、浙江蒼南（四季柚）、浙江常山（常山胡柚）、福建漳州（琯溪蜜柚）、重慶墊江（墊江白柚），剝?nèi)ス夂?，將柚子皮置于恒溫干燥箱中?0 ℃烘干24 h，粉碎，過100 目篩后備用。

1.2 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：Waters XBrigde C18色譜柱（150 mm×4.6mm，3.5μm）；流動(dòng)相 A 為乙腈，流動(dòng)相 B 為 0.05mol/L乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸）；柱溫為30 ℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件Table 2 The mobile phase gradient program

質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧電離（electron spray ionization，ESI），采用正離子（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）模式掃描，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)；離子源溫度為500 ℃。ESI+模式時(shí)：毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔氣流速為50 L/h，脫溶劑氣溫度為350 ℃，去溶劑氣流量為700 L/h；ESI-模式時(shí)：毛細(xì)管電壓為2.2 kV，錐孔氣流速為50 L/h，脫溶劑氣溫度為400 ℃，去溶劑氣流量為800 L/h。8 種香豆素及其衍生物的電離方式、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表3 香豆素及其衍生物的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometric parameters of coumarin and its derivatives

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取柚子皮粉5 g（精度至0.1 mg）置于100 mL離心管中，加入20 mL 甲醇，渦旋混合后，在超聲波水浴中超聲提取30 min，以10 000 r/min 離心5 min，收集上清液；殘?jiān)?0 mL 甲醇超聲提取2 次，合并上清液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5 mL；濃縮液經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化，凈化液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，濾液供LC-MS/MS 測(cè)定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

分別移取香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10.0 mg/mL）適量置于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度依次為 0.01、0.05、0.10、0.50、1.0 μg/mL的香豆素及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)LC-MS/MS 測(cè)定，以香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以其相對(duì)應(yīng)的色譜峰響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵將1.0 μg/mL 的香豆素及其衍生物單標(biāo)連續(xù)直接進(jìn)樣，采用正負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描，以選擇準(zhǔn)分子離子（母離子）和電離方式。結(jié)果表明：雙香豆素和醋硝香豆素在電噴霧負(fù)離子（ESI-）電離方式下，可獲得響應(yīng)值較高的[M-H]-母離子；香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6－甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、環(huán)香豆素在電噴霧負(fù)正離子（ESI+）電離方式下，可獲得響應(yīng)值較高的[M+H]+母離子；采用子離子掃描方式對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，通過優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，使得8 種香豆素及其衍生物的母離子及其子離子的相對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大，將響應(yīng)值最大的子離子設(shè)為定量離子，響應(yīng)值較穩(wěn)定的子離子設(shè)為定性離子，8 種香豆素及其衍生物的質(zhì)譜參數(shù)信息具體見表3，質(zhì)譜總離子流圖見圖1。

2.2 色譜柱的選擇

分別考察了Waters XTerra MS C18、Waters XBrigde C18、Hypersil BDS C18、Symmetry C18等不同微粒填料的色譜柱對(duì)8 種香豆素及其衍生物的分離效果（圖1）。結(jié)果表明：在不同型號(hào)的C18柱上，8 種香豆素及其衍生物的分離效果存在顯著性差異，特別是當(dāng)采用Wa－ters XBrigde C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）色譜柱時(shí)，各化合物的色譜峰更為符合正態(tài)分布，且分離效果好，響應(yīng)值較高，故選擇Waters XBrigde C18作為分析柱。

圖1 香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of coumarin and its derivatives

2.3 流動(dòng)相的選擇

采用Waters XBrigde C18作為分析柱，分別考察甲醇/乙腈和不同濃度的乙酸銨溶液為流動(dòng)相體系時(shí)對(duì)香豆素及其衍生物的色譜分離及其離子化響應(yīng)情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，香豆素及其衍生物的質(zhì)譜響應(yīng)值和保留時(shí)間隨著乙酸銨濃度的改變而發(fā)生變化，當(dāng)乙酸銨濃度為0.05 mol/L 時(shí)，基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱，且保留時(shí)間適中，特別是當(dāng)0.05 mol/L 乙酸銨溶液中添加0.1%甲酸時(shí)，可提高香豆素及其衍生物的質(zhì)譜響應(yīng)值和靈敏度（圖1）。故選擇乙腈-0.05 mol/L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相。

2.4 萃取溶劑的選擇

考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等萃取溶劑對(duì)8 種香豆素及其衍生物的萃取效果見圖2。

圖2 萃取溶劑對(duì)香豆素及其衍生物的萃取效果Fig.2 Effect of extraction solvent on the effect of coumarin and its derivatives

從圖2可以看出：按8 種香豆素及其衍生物平均萃取率大小依次排序?yàn)椋杭状迹?6.2%）＞乙腈（91.5%）＞乙酸乙酯（88.4 %）＞二氯甲烷（84.1 %）＞正己烷（67.3%），其中甲醇對(duì)8 種香豆素及其衍生物的萃取率在87.6%～99.4%之間，平均值為96.2%。故選擇甲醇作為萃取溶劑。

2.5 凈化柱的選擇

考察WCX（弱陽離子柱）、WAX（弱陰離子柱）、MCX（混合型陽離子柱）、MAX（混合型陰離子柱）、HLB（親水-親酯柱）、AluN（中性氧化鋁柱）等不同極性固相萃取柱對(duì)8 種香豆素及其衍生物的凈化效果見圖3。

從圖3中可知，HLB（親水-親酯柱）對(duì)8 種香豆素及其衍生物的平均凈化率最高（平均凈化率為96.3%），這可能是因?yàn)镠LB 具有親水-親酯平衡化學(xué)結(jié)構(gòu)，對(duì)不同極性的香豆素及其衍生物混合物具有良好的均衡吸附作用。故選擇HLB 作為凈化柱。

圖3 不同固相萃取柱對(duì)香豆素及其衍生物平均凈化率的影響Fig.3 Effect of solid phase extraction column on the recovery rate of coumarin and its derivatives

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

為提高本文所建LC-MS/MS 法的特異性和降低樣品基質(zhì)對(duì)香豆素及其衍生物含量測(cè)定的影響，考察了香豆素及其衍生物在柚子皮萃取液和純乙腈兩種不同基質(zhì)中的響應(yīng)值比值來衡量基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）。ME/%=A/B×100%，其中 A 為柚子皮萃取液中香豆素及其衍生物的響應(yīng)值，B 為純乙腈中香豆素及其衍生物的響應(yīng)值；若ME＞10%，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若-10%＜ME＜10%，表明不存在基質(zhì)干擾效應(yīng)；若ME＜-10%時(shí)，表明存在基質(zhì)減弱效應(yīng)。結(jié)果表明，在柚子皮萃取液和純乙腈兩種基質(zhì)中分別加入10.0、500.0、1 000.0 μg/kg 3 種低中高濃度的 8 種香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，經(jīng)本文所建LC-MS/MS法測(cè)定柚子皮中8 種香豆素及其衍生物的基質(zhì)效應(yīng)ME 值在-3.7%～4.6%見表4，這表明不存在基質(zhì)干擾效應(yīng)。

表4 香豆素及其衍生物在純乙腈和柚子皮中的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Matrix effect of coumarin and its derivatives in pure acetonitrile and Citrus maxima

2.7 線性范圍和檢出限

在空白柚子皮中添加不同濃度的香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLCMS/MS 條件”進(jìn)行測(cè)定，以香豆素及其衍生物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL），以其相對(duì)應(yīng)的色譜峰響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y，cps），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算回歸方程；在空白柚子皮中添加一系列低濃度的香豆素及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLC-MS/MS 條件”進(jìn)行測(cè)定 11 次，分別以 3 倍信噪比（S/N=3）和 10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算方法檢出限（LODs）和定量限（LOQs）見表5。

表5 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限（n=6）Table 5 Linear range，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation（n=6）

從表5中可知：在 0.010μg/mL～1.0 μg/mL 范圍內(nèi)，香豆素及其衍生物具有良好的線性關(guān)系（R2≥0.999 5）；LODs 在 3.0 μg/kg ～4.5 μg/kg；LOQs 在 10.0 μg/kg ～15.0 μg/kg。

2.8 加標(biāo)回收率與精密度

分別在空白柚子皮中添加10.0（低濃度）、500.0（中濃度）、1 000.0 μg/kg（高濃度）3 種水平的香豆素及其衍生物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLC-MS/MS 條件”進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度測(cè)定見表6。

從表6中可知，香豆素及其衍生物的平均加標(biāo)回收率為90.4%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為 0.9 %～4.1 %，該方法的準(zhǔn)確度、精密度均符合方法學(xué)的要求。

表6 加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 6 Recoveries and precision（n=6）

2.9 實(shí)際樣品的檢測(cè)

將6 份來自不同產(chǎn)地的柚子皮（沙田柚、化州柚、四季柚、常山胡柚、琯溪蜜柚、墊江白柚），按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLC-MS/MS 條件”進(jìn)行測(cè)定柚子皮中香豆素及其衍生物的組成及其含量見表7。

表7 實(shí)際柚子皮中香豆素及其衍生物的組成及其含量Table 7 Composition and content of coumarin and its derivatives in Citrus maxima

從表7中可知，柚子皮中含有一定量的香豆素及其衍生物，這與古淑儀等[11]、王輝等[13]關(guān)于柚子皮中香豆素及其衍生物的研究報(bào)道一致；6 種不同品種的柚子皮中均含有7-甲氧基香豆素，且7-甲氧基香豆素含量較高，含量在 11.4 μg/kg～123.7 μg/kg，而 7-甲氧基香豆素具有一定的生物活性的藥物，具有平喘、祛痰、鎮(zhèn)咳的作用，該成分可能與柚子具有的暖胃、化痰、潤化喉嚨等食療作用相關(guān)；在所檢的6 種柚子皮中，均未檢出香豆素、6-甲基香豆素、環(huán)香豆素、雙香豆素；不同品種的柚子皮中含有的香豆素及其衍生物不同，這可能與品種、氣候、貯藏時(shí)間等因素不同而引起的差異，可為農(nóng)業(yè)廢棄物柚子皮的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論

針對(duì)6 份不同產(chǎn)地的柚子皮，經(jīng)甲醇超聲提取，Oasis HLB 固相萃取柱凈化，Waters XBrigde C18色譜柱分離，以乙腈和0.05 mol/L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)，建立了液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定柚子皮中8 種香豆素及其衍生物的檢測(cè)方法。結(jié)果表明：在0.010 μg/mL～1.0 μg/mL范圍內(nèi)，香豆素及其衍生物具有良好的線性關(guān)系（R2≥0.999 5）；方法檢出限在 3.0 μg/kg～4.5 μg/kg，定量限在10.0 μg/kg～15.0 μg/kg；加標(biāo)回收率在 90.4%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～4.1%；在6 種不同品種的柚子皮中檢出7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、醋硝香豆素，其中7-甲氧基香豆素含量較高，含量在 11.4 μg/kg～123.7 μg/kg，該成分可能與柚子具有暖胃、化痰、潤化喉嚨等食療作用相關(guān)，這為柚子皮綜合開發(fā)利用提供參考。