謝紀珍，崔師睿，周 沖*，尹寧寧，姜曉飛

（1.山東省食品藥品審評認證中心，山東 濟南 250014；2.山東農(nóng)業(yè)工程學院，山東 濟南 250100）

復方氨基酸（15）腹膜透析液是一種用氨基酸替代葡萄糖作為滲透劑，用于營養(yǎng)不良的腹膜透析患者的新型透析治療產(chǎn)品。其處方組成復雜，含有包括色氨酸在內(nèi)的15種氨基酸等，目前測定氨基酸含量的方法很多，包括高效液相色譜法（HPLC）、氨基酸分析儀、衍生化法等[1-2]，但測定各種氨基酸降解產(chǎn)物的方法較少，本文選擇穩(wěn)定性較差的色氨酸為例[3]，對其檢測方法進行研究。在日常審評過程中發(fā)現(xiàn)，不同檢測方法檢出的色氨酸中降解產(chǎn)物和雜質(zhì)個數(shù)均不同，通過對比美國藥典、歐洲藥典、英國藥典等收載的各種氨基酸原料的檢測方法，色氨酸是唯一一個采用HPLC測定降解雜質(zhì)的氨基酸，其中歐洲藥典對色氨酸雜質(zhì)的檢測相對完整，其收錄的色氨酸原料的雜質(zhì)從合成過程中引入的雜質(zhì)和降解雜質(zhì)共有12個，并對其中的雜質(zhì)A采用HPLC法檢測[5-8]。通過研究發(fā)現(xiàn)，該方法在評價色氨酸原料的穩(wěn)定性方面基本可行，但復方氨基酸（15）腹膜透析液含有十幾種氨基酸組分，這些組分會干擾色氨酸雜質(zhì)的測定，上述藥典中的檢測方法專屬性較差，不能有效地評價色氨酸的穩(wěn)定性，為此本研究對檢測方法進行了優(yōu)化和驗證。

在參考文獻的基礎(chǔ)上[4,9-10]，本研究進一步優(yōu)化色譜條件，建立了一種專屬性更強的方法檢測制劑中色氨酸的降解雜質(zhì)，測定并比較了自制復方氨基酸（15）腹膜透析液與上市品中的色氨酸降解雜質(zhì)，為與本品類似的制劑產(chǎn)品開發(fā)提供了一種有效的質(zhì)量控制和評價手段。

1 材料與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀，DAD檢測器，自動進樣器，Aglient Chemstation色譜工作站；XS205型電子天平（梅特勒-托利多）；PHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）。色氨酸（中國食品藥品檢定研究院，批號140624-201506）；色氨酸雜質(zhì)B（加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司，批號1385-088A2）；色氨酸雜質(zhì)C（犬尿氨酸，美國Sigma-Aldrich公司，批號BCBN9808V）；色氨酸雜質(zhì)E（N-甲酰犬尿氨酸，雜質(zhì)批號1406-083A3），色氨酸雜質(zhì)G（2-羥基色氨酸，批號1406-094A3，加拿大TLC Pharmaceutical Standards公司）。復方氨基酸（15）腹膜透析液（青島力騰化工醫(yī)藥研究有限公司，批號C17031701，C17031702，C17031703）；另選某公司已上市復方氨基酸（15）腹膜透析液做對比研究，批號：S15G03096。

2 方法

2.1 雜質(zhì)對照溶液配制

精密稱取雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥基色氨酸適量，加水制成濃度分別為99.6，107.8，119.2，97.2 μg/ml的對照溶液。2～8 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 空白對照溶液配制

按照復方氨基酸（15）腹膜透析液處方，稱取除色氨酸以外的其他組分，加水，制成空白對照溶液。

2.3 對照混合溶液配制

精密稱取雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥色氨酸適量，用純化水溶解，制成各組分濃度約為0.50 μg/ml對照溶液，量取1 ml，加入100 ml復方氨基酸（15）腹膜透析液樣品中。

2.4 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以純水為流動相A，以0.02 mol/L磷酸二氫鉀（磷酸調(diào)pH 2.7）-乙腈-異丙醇（650:175:175）為流動相B，柱溫50 ℃，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為250 nm。

表1 流動相洗脫梯度

2.5 測定法

取上述雜質(zhì)對照溶液、空白對照溶液、對照混合溶液以及自制和上市的復方氨基酸（15）腹膜透析液各50 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖至保留時間70 min。各雜質(zhì)按外標法計算不得大于0.2 %，最大其他雜質(zhì)不得大于0.2 %，總雜質(zhì)不得過1.0 %。

3 方法對比與方法學驗證

3.1 色譜條件比較

氧化破壞樣品制備 稱取色氨酸對照品適量，加純化水溶解，取5 ml加30 %雙氧水5 ml，置入10 ml量瓶，于60 ℃下放置5 h，取出待用。取氧化破壞樣品溶液，分別用歐洲藥典8.0[2]中收載的色譜條件與上述優(yōu)化后色譜條件分析測定。

結(jié)果：由圖1、圖2比較可見，氧化破壞后的樣品采用自研的方法檢測可將4個雜質(zhì)全部檢出，而采用歐洲藥典方法檢出的雜質(zhì)個數(shù)和分離度均較差（本文各圖中標號代表：1：雜質(zhì)B，2：犬尿氨酸，3：N-甲酰犬尿氨酸，4：2-羥基色氨酸，5：色氨酸，6：苯丙氨酸，7：酪氨酸，8：雙氧水）。

圖1 歐洲藥典方法測定氧化后色氨酸溶液色譜圖

3.2 專屬性

3.2.1 原輔料空白試驗 按處方配制除色氨酸以外的各原輔料空白溶液、各雜質(zhì)混合對照溶液、以及加各雜質(zhì)對照的混合樣品溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法測定。

結(jié)果：由圖3～圖5可見，色氨酸的4個雜質(zhì)在復方氨基酸（15）腹膜透析液的樣品中可有效分離，樣品中的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸均不影響4個雜質(zhì)的測定。

圖3 雜質(zhì)對照溶液色譜圖

圖4 空白溶液色譜圖

圖5 加雜質(zhì)對照的混合樣品溶液色譜圖

3.2.2 破壞性試驗 將氨基酸（15）腹膜透析液分別于高溫、光照、氧化條件下破壞。

圖6 注射液光照破壞色譜圖

圖7 注射液氧化破壞色譜圖

圖8 注射液高溫破壞色譜圖

結(jié)果：本方法能良好的分離注射液在光照、高溫、氧化條件下降解各雜質(zhì)，且主峰純度符合要求。

3.3 復方氨基酸（15）腹膜透析液樣品中雜質(zhì)檢測

由圖9、圖10可見，自制的復方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸的雜質(zhì)要低于上市品（已上市12個月）中的雜質(zhì)水平。

圖9 氨基酸（15）腹膜透析液上市樣品色譜圖

圖10 氨基酸（15）腹膜透析液自制樣品色譜圖

3.4 線性范圍

分別取2.1項下各對照溶液適量，加水稀釋成系列濃度后照2.4和2.5項下色譜條件與測定法進行測定。以峰面積對濃度作回歸方程，結(jié)果見表2，表明各雜質(zhì)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，符合要求。

表2 雜質(zhì)的標準線性曲線

3.5 檢測限、定量限

分別取2.1項下各對照溶液適量，加水連續(xù)稀釋后照2.4和2.5項下色譜條件與測定法測定，直至信噪比為10:1時，該濃度為定量限濃度；當信噪比為3:1時，該濃度為檢出限濃度；配制6份定量限濃度對照混合溶液，連續(xù)進樣，計算其RSD，應符合要求。6份定量限樣品峰面積RSD值小于5 %，保留時間RSD小于2 %。結(jié)果見表3。

表3 雜質(zhì)的檢測限和定量限

3.6 精密度

重復性試驗：取2.2項下混合樣溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法，測定6份樣品中雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸、2-羥基色氨酸的含量。結(jié)果表明，6份樣品中雜質(zhì)B平均含量為0.5362 μg/ml，RSD為4.6 %，犬尿氨酸平均含量為0.5399 μg/ml，RSD為0.8 %，N-甲酰犬尿氨酸平均含量為0.5216 μg/ml，RSD為2.6 %，2-羥基色氨酸平均含量為0.5488 μg/ml，RSD為2.2 %。

表4 重復性試驗結(jié)果

中間精密度試驗：取2.2項下混合樣溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法，由不同的儀器、試驗人員測定相同的6份樣品雜質(zhì)含量，計算12份樣品的RSD值。結(jié)果表明，12份樣品中雜質(zhì)B平均含量為0.5154 μg/ml，RSD為6.6 %，犬尿氨酸平均含量為0.5197 μg/ml，RSD為4.2 %，N-甲酰犬尿氨酸平均含量為0.5248 μg/ml，RSD為3.0 %，2-羥基色氨酸平均含量為0.5406 μg/ml，RSD為4.1 %。

結(jié)論：由上述重復性試驗與中間精密度試驗結(jié)果可知，該方法精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗

取2.1項下各對照溶液，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法，分別于0，4，8，12，24 h取樣測定其穩(wěn)定性。結(jié)果雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羥基色氨酸的樣品峰面積RSD分別為1.9 %，0.9 %，1.1 %和0.7 %。

3.8 回收率

精密量取2.1項下各對照溶液適量，按照低、中、高3個濃度稀釋配制含有4種雜質(zhì)的溶液，每個濃度配制3份，共配制9份樣品溶液，其中低濃度為定量限濃度。照2.4和2.5項下色譜條件與測定法。結(jié)果雜質(zhì)B、犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸和2-羥基色氨酸的平均回收率分別為101.78 %，106.31 %，104.86 %和100.71 %。詳見表5～8。

表5 雜質(zhì)B回收率試驗結(jié)果（n=9）

表6 犬尿氨酸回收率試驗結(jié)果（n=9）

表7 N-甲酰犬尿氨酸回收率試驗結(jié)果（n=9）

表8 2-羥基色氨酸回收率試驗結(jié)果（n=9）

3.9 耐用性

分別考察流動相比例、流動相pH值、柱溫、檢測波長、流速不同色譜柱等方法因素發(fā)生變化時，該方法的耐受程度。每個條件下各測試2次?？山邮艿臉藴蕿椋焊麟s質(zhì)峰的拖尾因子不得大于2.0，雜質(zhì)峰與其他成分峰必須達到基線分離；各條件下的雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)（n=6）的相對標準差應不大于2.0 %，雜質(zhì)含量的絕對值在±0.1 %以內(nèi)。

結(jié)果表明，上述各影響因素變化條件下，除流速為0.6 ml/min時分離度最小為1.43，其余各條件理論塔板數(shù)均大于10 000，分離度均大于1.5。犬尿氨酸、N-甲酰犬尿氨酸各影響因素條件下6份含量數(shù)據(jù)RSD值小于2.0 %，雜質(zhì)B略過，最高RSD值為7.1 %，但對有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果無明顯影響。

綜合上述，該方法空白原輔料無干擾，有關(guān)物質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離，專屬性強；定量限濃度均低于0.05 %，該方法靈敏度高；準確度、精密度良好，各雜質(zhì)自定量限濃度至0.5 %范圍內(nèi)濃度與峰面積成良好的線性關(guān)系；溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，能夠滿足測定需求，系統(tǒng)適用性與耐用性良好。該方法能夠滿足本品中色氨酸有關(guān)物質(zhì)檢測要求。

3.10 樣品測定

取自制復方氨基酸（15）腹膜透析液3批及市售產(chǎn)品，照2.4和2.5項下色譜條件與測定法測定。結(jié)果見表9。

表9 復方氨基酸（15）腹膜透析液中色氨酸降解產(chǎn)物測定結(jié)果

4 討論

歐洲藥典收錄的檢測方法在評價復方氨基酸制劑中色氨酸雜質(zhì)時，受其他氨基酸組分影響，其專屬性差，不能有效檢測色氨酸的降解雜質(zhì)。我們在其方法基礎(chǔ)上改進優(yōu)化了HPLC色譜條件，可對其主要的降解產(chǎn)物進行分離檢測，經(jīng)方法學驗證，可用于多種含色氨酸的復方氨基酸制劑工藝和質(zhì)量評價，希望給研究者提供參考。