李 燕，同曉霞

（陜西省延安市藥品檢驗所，陜西 延安 716000）

丹膝顆粒具有平肝養(yǎng)陰、清熱除煩等功效，常用于中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)和腦梗塞恢復(fù)期瘀血阻絡(luò)兼腎虛證、腰膝酸軟等，在心血管疾病的臨床應(yīng)用較廣，是由丹參、牡丹皮、天麻、牛膝、淫羊藿等十二味中藥制成[1-11]。目前，國家標(biāo)準(zhǔn)中，僅針對丹參中的丹酚酸B含量和天麻中天麻素含量進(jìn)行了控制[12]，未針對牡丹皮中的丹皮酚和丹參中的丹參素進(jìn)行質(zhì)量控制。為更有效地評價丹膝顆粒的質(zhì)量情況，實驗開發(fā)一種利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）同時測定丹膝顆粒中的丹酚酸B、丹參素和丹皮酚的分析方法，為完善和修訂丹膝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 infinity液相色譜儀， DAD檢測器（安捷倫）；XS205 DU十萬分之一電子天平（梅特勒）；SK3300LH型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（廣州滬瑞明儀器公司）；HY-4型振蕩器（天津泰斯特）；Milli-Q純水儀（密理博）；T25渦旋混合器（艾卡科技公司）。

1.2 試藥

丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111562-201716）；丹參素鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110855-201614）；丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110708-201407）；丹膝顆粒（九芝堂，批號：20180425，規(guī)格：10 g/袋）。甲醇、乙腈（Merck公司，色譜純）；甲酸（國藥集團(tuán)，分析純）；純化水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Agilent Zorbax eclipse SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：282 nm；進(jìn)樣體積：20 μl；流動相A：0.1 %甲酸溶液；流動相B：乙腈；丹參素、丹皮酚和丹酚酸B分離度均不得低于1.5；理論塔板數(shù)均不低于2000；梯度洗脫程序見表1。供試品溶液的HPLC圖譜見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 丹膝顆粒供試品溶液的HPLC圖譜

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備溶液的制備 分別取標(biāo)準(zhǔn)品丹酚酸B對照品、丹參素對照品和丹皮酚對照品各約50 mg，精密稱定，置入同一50 ml量瓶，加約30 ml甲醇，使溶解，再用甲醇定容至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取丹膝顆粒10袋，取出內(nèi)容物，置入研缽中研成細(xì)粉；精密稱取研細(xì)后的樣品約1.0 g，置入100 ml量瓶，加甲醇約70 ml，超聲提取約20 min；取出放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取2.2.1項對照品儲備溶液一定量，配制成質(zhì)量濃度依次為2.0，4.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/ml溶液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；按2.1項色譜條件，分別進(jìn)樣上述溶液。以濃度（X）與其對應(yīng)的峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程；以3倍信噪比計算3種待測化合物的檢出限，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2 加樣回收試驗 取研細(xì)后的丹膝顆粒細(xì)粉，精密稱取約1.0 g，同法稱取6份，分別置入100ml量瓶中，再分別加入標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.0 ml，后續(xù)按2.2.2項供試品溶液配制方式進(jìn)行前處理；按2.1項色譜條件，分別進(jìn)樣上述加標(biāo)溶液，計算回收率及6次加標(biāo)RSD值。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果

2.3.3 精密度與重復(fù)性試驗 取同一批號丹膝顆粒樣品約1.0 g，精密稱定，按2.2.2項供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，同法配制6份供試品溶液；再按2.1項色譜條件，分別進(jìn)樣上述供試品溶液，計算6份樣品測定結(jié)果的重復(fù)性RSD：丹參素2.3 %、丹皮酚3.7 %、丹酚酸B 2.9 %；同一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計算測定結(jié)果的精密度RSD：丹參素0.89 %、丹皮酚2.4 %、丹酚酸B 1.1 %。

2.3.4 溶液穩(wěn)定性考察 取丹膝顆粒樣品，按2.2.2項供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，按2.1項色譜條件，供試品溶液分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析。計算6次計算結(jié)果的RSD值分別為：丹參素1.1 %、丹皮酚1.9 %、丹酚酸B 3.2 %；結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測定

取批號為20180407，20180423，20180814的丹膝顆粒樣品，按2.2.2項供試品溶液配制方法進(jìn)行樣品前處理，再按2.1項色譜條件，進(jìn)樣分析，計算檢測結(jié)果。見表4。

表4 樣品檢測結(jié)果

3 討論

3.1 樣品前處理方法的確定

考察了加熱回流提取法和超聲提取法對3種待測化合物進(jìn)行提取前處理，處理液進(jìn)液相色譜檢測。結(jié)果表明，加熱回流提取法提取3種物質(zhì)回收率略高于超聲提取法，但加熱回流提取法提取到更多的雜質(zhì)；超聲提取法雜質(zhì)峰最少，且雜質(zhì)響應(yīng)值更低，計算得到3種化合物的檢出限更低?？紤]到實驗操作的簡便等因素，故選擇超聲提取法作為樣品的前處理方法。

3.2 檢測波長的確定

取標(biāo)準(zhǔn)品丹酚酸B、丹參素和丹皮酚，分別配制質(zhì)量濃度為20 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外-可見分光光度計進(jìn)行光譜掃描，掃描波長在190～600 nm范圍，得到3種物質(zhì)的紫外吸收情況。丹酚酸B在254±2 nm、285±2 nm處有最大吸收；丹參素在225±2 nm，278±2 nm處有最大吸收；丹皮酚在228±2 nm，275±2 nm處有最大吸收。為使各物質(zhì)響應(yīng)值保持一致，故選擇282 nm作為檢測波長。

3.3 洗脫方法的確定

丹酚酸B、丹參素和丹皮酚3種化合物，極性差別比較大，極性由強(qiáng)到弱為：丹參素、丹皮酚、丹酚酸B。實驗選擇等度洗脫的方式，設(shè)定流動相為乙腈：0.1 %甲酸水溶液為20:80比例的條件下，丹參素、丹皮酚和丹酚酸B出峰時間依次為3.21，32.43，35.15 min。為提高分析檢測效率，盡可能縮短分析時間的同時保證3種化合物有較好的分離，實驗采用梯度洗脫條件對3種化合物進(jìn)行分離，經(jīng)過調(diào)試選擇梯度洗脫條件見1.2項色譜條件。

本實驗建立了一種利用RP-HPLC同時測定丹膝顆粒中丹酚酸B、丹皮酚和丹參素的分析方法，實驗首選優(yōu)化了前處理方法和色譜條件；并對方法的加樣回收率、檢出限、線性、重復(fù)性等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法具有前處理簡單、檢出限低、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，為全面控制丹膝顆粒的質(zhì)量提供技術(shù)參考。