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        黑牛肝菌多糖結(jié)構(gòu)及體外抗腫瘤活性研究

        2019-08-27 08:11:08宋志強(qiáng)侯怡鈴
        食品與藥品 2019年4期
        關(guān)鍵詞:牛肝菌培養(yǎng)箱抑制率

        唐 賢,丁 祥,朱 淼,宋志強(qiáng),侯怡鈴*

        (1.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 南充 637009;2.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,四川 南充 637009)

        黑牛肝菌又稱銅色牛肝菌(Boletus aereus),屬牛肝菌科牛肝菌屬,主要分布于四川、貴州、云南、歐洲等地[1],高蛋白、低脂肪、低熱量,味道鮮美,營養(yǎng)價(jià)值高,具有極高的商業(yè)價(jià)值[2],近年,其多糖類成分的研究引起了人們的關(guān)注。目前對于黑牛肝菌多糖的研究主要集中于其分離純化、抗氧化及降血脂活性[4-6],對黑牛肝菌多糖的體外抗腫瘤活性研究未見報(bào)道。本文參考文獻(xiàn)方法[7]提取純化黑牛肝菌多糖,并采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、核磁共振氫譜(1H NMR)技術(shù)表征其結(jié)構(gòu),并研究其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響,以冀為黑牛肝菌多糖的深入研究提供參考。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        TU-1901/1900 系列傅立葉紅外光譜儀(Thermo Fisher Scientific);BPN-80CH(UV)CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific);96孔板(Corning); SE-CJ-1F型超凈工作臺 (蘇州安泰);酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠);水浴鍋(上海光地)。

        1.2 材料

        黑牛肝菌(Boletus aereus)子實(shí)體采集于四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣,洗凈,置60 ℃烘箱烘干,保存于西南野生動植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

        1.3 試劑

        DEAE-52纖維素柱(上海源葉生物);透析袋(截留分子量≥7000 Da)(Biosharp 生物科技);葡聚糖凝膠Sephadex G-200(Solarbio);NaOH(天津津北); NaCl,濃硫酸,濃鹽酸(成都科隆);苯酚(四川航嘉);無水乙醇[上緯精細(xì)化工(上海)公司],以上試劑均為分析純。RPMI-1640 培養(yǎng)基,雙抗,胎牛血清(Thermo Fisher Scientific);脂多糖(LPS,Sigma);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8試劑盒)[博升生物科技(上海)]。

        2 方法

        2.1 黑牛肝菌多糖提取與純化

        精確稱取黑牛肝菌子實(shí)體100 g,置60 ℃烘箱烘干,粉碎,細(xì)粉經(jīng)熱水(96 ℃)浸提,濃縮,乙醇沉淀(1:4),Sevag 法脫蛋白,60 ℃低溫干燥等步驟后,得粗多糖。將粗多糖加蒸餾水溶解,取5 ml加入活化平衡好的DEAE-52纖維素柱,用0.01 mol/L氯化鈉溶液過柱,流速為5 ml/min,收集500 ml洗脫液。洗脫多糖采用硫酸-苯酚法測定。將洗脫液濃縮至5 ml,置于透析袋中,并用蒸餾水持續(xù)透析2 d,每隔8 h換一次蒸餾水,透析后洗脫液冷凍干燥[8],得到純化后的黑牛肝菌多糖(BA-1)。

        2.2 BA-1結(jié)構(gòu)初步表征

        稱取BA-1 3 mg,將其與適量干燥的 KBr研磨混勻后壓片,進(jìn)行FT-IR分析,波數(shù)范圍4000~400 cm-1。稱取BA-1 10 mg,溶于600 μl D2O,并在核磁共振儀上記錄1H NMR數(shù)據(jù)。

        2.3 BA-1對3種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

        采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8法)測定BA-1對MFC細(xì)胞,CT26.WT細(xì)胞和S180細(xì)胞增殖的抑制作用。選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后,用1640完全培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋至1×105CFU/ml,吸取細(xì)胞懸液100 μl至96孔板,置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后,加入不同質(zhì)量濃度的BA-1溶液(最終質(zhì)量濃度為2.5,5,10,20,25 μg/ml)100 μl;陽性對照組每孔加入 LPS溶液(最終質(zhì)量濃度5 μg/ml)100 μl,空白組每孔加入完全培養(yǎng)液100 μl。于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,分別向每孔加入CCK-8 5 μl,置CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h,酶標(biāo)儀(450 nm)檢測。按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

        式中,P為細(xì)胞抑制率;A1為空白組平均吸光度值;A2為實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 FT-IR分析

        采用OMNIC 8.2軟件處理分析BA-1的FT-IR光譜。BA-1的FT-IR光譜圖在4000~400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)有典型的吸收峰(見圖1):3700~3100 cm-1范圍內(nèi)的寬吸收峰為O-H伸縮振動,3010~2850 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為-C-H, -CH2,-CH3伸縮振動,1800~1600 cm-1為 C=O,C=C伸縮振動峰,1200~1000 cm-1為糖類 C-O伸縮振動峰,620.41 cm-1的峰被指定為 C-H伸縮振動峰。FT-IR數(shù)據(jù)顯示,BA-1的多糖特征峰明顯,無其他雜質(zhì)峰,為均一多糖。

        圖1 黑牛肝菌多糖FT-IR圖譜

        3.2 1H NMR分析

        采用MestReNova軟件處理BA-1的1H NMR圖譜,見圖2。δ4.70和δ4.67分別為水和D2O的氫信號。BA-1的1H NMR(400 MHz)波譜分為兩部分:(1)異頭氫區(qū),δ5.90~4.30;(2)環(huán)質(zhì)子區(qū),δ4.40~δ3.00[9]。BA-1有4個異頭氫,δ值分別為5.02,4.99,4.98,4.91,一般認(rèn)為吡喃糖殘基的α構(gòu)型異頭氫的δ>5.00,β構(gòu)型異頭氫的δ<5.00[10]。這表明BA-1至少由4個單糖組成,且不僅含α構(gòu)型吡喃糖,還可能含β構(gòu)型吡喃糖。

        圖2 黑牛肝菌多糖的1H NMR圖譜

        3.3 黑牛肝菌多糖對MFC細(xì)胞增殖的抑制作用

        MFC細(xì)胞是小鼠胃癌細(xì)胞系,貼壁生長。用不同質(zhì)量濃度的黑牛肝菌多糖溶液刺激MFC細(xì)胞,結(jié)果見圖3。與空白組相比,LPS可極顯著抑制MFC細(xì)胞增殖(P<0.01);BA-1濃度為5~20 μg/ml時(shí)可在一定程度上抑制MFC細(xì)胞增殖。與空白組相比,當(dāng)BA-1濃度為10,15 μg/ml時(shí),對MFC細(xì)胞有極顯著抑制作用(P<0.01);BA-1濃度為20,25 μg/ml時(shí),能顯著抑制MFC細(xì)胞增殖(P<0.05),BA-1濃度為15 μg/ml時(shí)對MFC細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯,抑制率為30.68 %。

        圖3 黑牛肝菌多糖對MFC細(xì)胞增殖的抑制作用

        3.4 黑牛肝菌多糖對S180細(xì)胞增殖的抑制作用

        S180細(xì)胞為小鼠 Ehrlich 腹水腫瘤細(xì)胞,以半懸浮生長。用不同質(zhì)量濃度的黑牛肝菌多糖溶液刺激S180細(xì)胞(見圖4)。與空白組相比,LPS能極顯著抑制S180細(xì)胞增殖(P<0.01);BA-1濃度為2.5~25 μg/ml時(shí),對S180細(xì)胞增殖有極顯著的抑制作用(P<0.01),BA-1濃度為15 μg/ml時(shí)對S180細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯,抑制率為32.68 %。

        圖4 黑牛肝菌多糖對S180細(xì)胞增殖的抑制作用

        3.5 BA-1對CT26.WT細(xì)胞增殖的抑制作用

        CT26.WT細(xì)胞為小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞,貼壁生長。用不同濃度的BA-1溶液刺激CT26.WT細(xì)胞,結(jié)果見圖5。與空白組相比,LPS 能顯著抑制CT26.WT細(xì)胞增殖(P<0.05);BA-1濃度為2.5~20 μg/ml時(shí),均能抑制CT26.WT細(xì)胞增殖(P<0.01),BA-1濃度為15 μg/ml時(shí)對CT26.WT細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯,抑制率為38.90 %。

        圖5 黑牛肝菌多糖對CT26.WT細(xì)胞增殖的抑制作用

        4 結(jié)論

        本文以四川省小金縣野生黑牛肝菌為研究對象,采用熱水浸提法、DEAE-52 纖維素柱層析法等分離純化得到黑牛肝菌多糖BA-1。采用FT-IR、1H NMR測定BA-1結(jié)構(gòu),F(xiàn)T-IR分析顯示有明顯的多糖結(jié)構(gòu)特征吸收峰,1H NMR圖譜顯示BA-1至少由4個單糖組成。

        用不同濃度的黑牛肝菌多糖BA-1分別刺激MFC細(xì)胞、CT26.WT細(xì)胞和S180細(xì)胞,探究BA-1對腫瘤細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示,與空白組相比,BA-1能在一定程度上抑制MFC細(xì)胞、CT26.WT細(xì)胞和 S180細(xì)胞增殖,BA-1濃度為15 μg/ml時(shí)對MFC細(xì)胞、CT26.WT細(xì)胞和S180細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯,分別為30.68 %,32.68 %和38.90 %。

        綜上,在體外實(shí)驗(yàn)中,黑牛肝菌多糖BA-1在一定程度上抑制MFC、 CT26.WT和S180 3種腫瘤細(xì)胞的增殖。BA-1是一類大分子物質(zhì),其結(jié)構(gòu)鑒定還需進(jìn)一步研究。本文為后續(xù)BA-1的結(jié)構(gòu)鑒定、生物活性研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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