李園園，史偉峰，江 濤，許德英

腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病最主要的病原體之一，除引起手足口病外，還能導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，已居丙類傳染病的首位，且呈上升趨勢，死亡率高。我國研制的首批EV71疫苗已于2016年上市，為控制暴發(fā)和流行提供了有效手段[1]。然而，針對EV71的治療仍以對癥治療為主，目前尚無理想有效的抗病毒藥物。蛋白酪氨酸激酶和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)信號通路是機(jī)體固有免疫反應(yīng)的必要條件，與病毒性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2-5]。已有報(bào)道，EV71感染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(rhabdomyosarcoma，RD)和THP-1細(xì)胞，JAK/STAT信號通路的反應(yīng)不同[6]。本研究擬在分析EV71感染THP-1細(xì)胞后，STAT1、ISGs的表達(dá)及沉默STAT1對ISGs轉(zhuǎn)錄、EV71/VP1復(fù)制的影響，探討STAT1在EV71感染中的作用和相關(guān)機(jī)制，為EV71的治療尋找新的靶點(diǎn)提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料人單核巨噬細(xì)胞(THP-1)和293T細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。STAT1、p-STAT1(signalway antibody)；HRP標(biāo)記的二抗(Santa Cruz公司)；GAPDH和相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(ProteinTech公司)；β-action、Anti-Enterovirus 71 VP1 antibody和相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(Abcam公司)； Trizol試劑(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；ABI7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)THP-1細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，THP-1細(xì)胞密度達(dá)到5×106時采用半定量換液或離心換液傳代培養(yǎng)，細(xì)胞密度不能超過1×107。293T細(xì)胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，每2～3 d傳代1次，傳代時棄掉培養(yǎng)基，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 shRNA慢病毒的包裝、濃縮與病毒滴度測定293T細(xì)胞密度約70%～80%時采用磷酸鈣法包裝慢病毒，轉(zhuǎn)染前4 h對細(xì)胞進(jìn)行換液，輔助質(zhì)粒pSpAX2 3.2 μg 、PMD-2G 1.8 μg和包裝質(zhì)粒shSTAT1 5 μg加入超純水至450 μL，混合均勻。將CaCl250 μL加入至含有質(zhì)粒的離心管中。將質(zhì)?！狢aCl2混合物加入至含有500 μL 2×HBS的離心管中，混勻后緩慢滴入培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染后16 h換液，48 h、72 h后收獲上清液，12 000 r·min-1離心5 min，用0.45 μm濾膜過濾，去掉細(xì)胞碎片沉渣。為了提高慢病毒的滴度，采用4 ℃超速離心機(jī)20 000 r·min-1離心90 min將慢病毒濃縮。采用流式細(xì)胞儀法測定病毒滴度，利用載體共表達(dá)的綠色熒光蛋白表達(dá)(GFP)在流式儀上進(jìn)行分析，計(jì)算表達(dá)熒光細(xì)胞的比例。病毒滴度的計(jì)算公式為：TU/mL=細(xì)胞數(shù)(以鋪時計(jì)，1×105)×熒光表達(dá)比例×103/慢病毒的體積(μL)。按照使用量分裝至EP管中置于-80 ℃保存。

1.2.3 重組shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞接種處于生長對數(shù)期的THP-1細(xì)胞到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL細(xì)胞密度為2×105·mL-1。設(shè)對照組和干擾組。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和制備的空載體病毒及干擾載體病毒滴度，以不同感染復(fù)數(shù)感染THP-1細(xì)胞，同時加入8 μg·mL-1的多聚凝胺(polybrene)，同時感染4個復(fù)孔。感染24 h后離心換液，將4個復(fù)孔的細(xì)胞至6孔板內(nèi)，每孔加入1 mL RPMI1640+10%FBS培養(yǎng)基，置37 ℃5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。感染后72 h，提取總RNA和蛋白。

1.2.4 qRT-PCR采用TRizol法裂解細(xì)胞并提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于熒光定量PCR。相關(guān)引物序列見表1。獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次，每次每個樣本每個基因作3個復(fù)孔，采用經(jīng)典的2-ΔCt計(jì)算相對表達(dá)量，ΔCt =(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照。

表1 引物序列

1.2.5 western blot收集對照組(0 h)和各實(shí)驗(yàn)組2、4、8、12、16和24 h的細(xì)胞，0 h未感染EV71，實(shí)驗(yàn)組EV71(MOI=5)感染細(xì)胞2、4、8、12、16和24 h，離心收集細(xì)胞，加入含PMSF的IP細(xì)胞裂解液，冰上裂解40 min，12 000 r·min-1，離心5 min，收集上清，采用BCA法測定總蛋白濃度。以每孔40 μg的蛋白量加樣至10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再將膠中的蛋白通過電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h，1∶1 000稀釋加入一抗，4 ℃孵育過夜。TBST振蕩洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后采用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，暗室曝光，顯影。

2 結(jié)果

2.1 EV71激活I(lǐng)FN-β和ISGs的轉(zhuǎn)錄EV71(MOI=1和MOI=5)感染THP-1細(xì)胞后8 h、24 h，細(xì)胞內(nèi)IFN-β mRNA的表達(dá)量均上調(diào)，與對照組(未感染EV71)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A和圖1B)。與對照組(未感染EV71)相比，EV71感染8 h時，MXA、OAS1、ISG56這3種ISGs mRNA的相對表達(dá)量分別上調(diào)了約11.6、11.2和17.3倍，且這種上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EV71感染24 h時，MXA、OAS1、ISG56這3種ISGs的表達(dá)量與8 h相比分別下降了4.4、4.6和9倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而當(dāng)EV71以MOI=5感染細(xì)胞8 h時，ISG15的表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)(圖1C和圖1D)。

圖1 EV71激活I(lǐng)FN-β和ISGs的轉(zhuǎn)錄

2.2 EV71感染促進(jìn)STAT1的磷酸化EV71(MOI=5)感染 THP-1細(xì)胞，隨著病毒感染時間的延長(2、4、8、12、16和24 h)，STAT1和p-STAT1的表達(dá)量呈依次增加趨勢，具有時間依賴性，與未感染EV71組相比，STAT1和p-STAT1的蛋白水平均明顯提高，見圖2。

2.3 特異性靶向STAT1的shRNA對THP-1細(xì)胞中STAT1蛋白表達(dá)的抑制作用采用特異性靶向STAT1的shRNA包裝慢病毒，感染THP-1細(xì)胞，48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot印跡檢測STAT1蛋白水平。結(jié)果顯示：與對照組相比， shSTAT1-256能顯著抑制STAT1蛋白表達(dá)水平，見圖3。因此選取shSTAT1-256用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 沉默STAT1基因?qū)SGs及EV71/VP1表達(dá)的影響慢病毒感染THP-1細(xì)胞并加入8 μg·mL-1的polybrene，增加干擾效率，得到THP-1-shRNA-STAT1和THP-1-shRNA-CON077細(xì)胞系，72 h后，Western blot結(jié)果顯示：與對照組相比，shRNA-STAT1感染的THP-1細(xì)胞組STAT1蛋白水平明顯降低(圖4A)。慢病毒shRNA-STAT1感染的THP-1細(xì)胞，經(jīng)EV71感染24 h時，與對照組相比，STAT1、p-STAT1和VP1的蛋白表達(dá)量下降(圖4B)，MXA、OAS1、ISG56的mRNA表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05)，VP1mRNA的表達(dá)量也下調(diào)(圖4C)。

圖2 EV71感染激活了STAT1的磷酸化

圖3 2種shRNA對STAT1蛋白干擾效率的影響

A:shRNA-STAT1感染后；B:經(jīng)EV71感染24 h后；C:EV71感染24 h后mRNA表達(dá)。圖4 沉默STAT1基因?qū)SGs及EV71/VP1表達(dá)的影響

3 討論

手足口病感染具有全球性，我國每年均有發(fā)生，發(fā)病率約為37.01/10萬～205.06/10萬，死亡率約為6.46/10萬～51.00/10萬，嚴(yán)重危害兒童健康，但是其致病機(jī)制仍在進(jìn)一步研究。在病原微生物感染早期，固有免疫反應(yīng)通過識別人類清道夫受體和P-選擇素糖蛋白配體-1等，激活一系列信號通路，對病毒的抑制和清除發(fā)揮重要作用[8]。

STAT1是STAT家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，具有廣泛的生物學(xué)作用，抑制腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、參與固有免疫反應(yīng)等。病毒感染機(jī)體時，促進(jìn)STAT1的活化發(fā)揮抗病毒作用，已有報(bào)道新城疫病毒的V蛋白、埃博拉病毒的VP24蛋白作用于STAT1磷酸化修飾在干擾素信號通路中發(fā)揮作用[9]，而STAT1乙?；⒎核鼗?、甲基化等不同修飾影響干擾素抑制乙肝病毒復(fù)制的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)的氨基末端區(qū)域可以抑制STAT1的轉(zhuǎn)錄和磷酸化調(diào)控干擾素反應(yīng)[11]，而有體外實(shí)驗(yàn)表明，STAT1缺乏時細(xì)胞不能應(yīng)答IFN-α和IFN-β的刺激，對病原微生物極其敏感。THP-1細(xì)胞是人體的單核巨噬細(xì)胞，具有免疫效應(yīng)，在STAT-1缺乏的THP-1內(nèi)，對EV71感染的機(jī)制還不明確，本研究采用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)，沉默THP-1細(xì)胞的STAT1，探討EV71感染沉默STAT1的THP-1細(xì)胞，干擾素刺激基因的變化及對病毒復(fù)制的影響。

采用EV71(MOI=1和MOI=5)感染THP-1細(xì)胞，PCR結(jié)果(圖1)顯示ISGs和IFN-β的表達(dá)量上調(diào)，Western blot結(jié)果(圖2)表明STAT1和STAT1磷酸化水平上調(diào)，這些結(jié)果提示EV71促使THP-1細(xì)胞內(nèi)STAT1入核，激活I(lǐng)SGs和IFN-β的表達(dá)，與報(bào)道的EV71感染的vero細(xì)胞內(nèi)IFN-β產(chǎn)生被抑制不同，不同的細(xì)胞對EV71感染反應(yīng)不同[2]。由于THP-1細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，傳統(tǒng)的RNAi技術(shù)干擾效率低，因此本研究設(shè)計(jì)shRNA-STAT1，磷酸鈣法包裝慢病毒，經(jīng)超速離心法濃縮后，流式細(xì)胞儀測定慢病毒滴度。慢病毒感染THP-1細(xì)胞24 h后，與對照組相比，STAT1表達(dá)下調(diào)(圖3A)。EV71感染24 h后，STAT1、p-STAT1、VP1和ISGs mRNA表達(dá)量下降(圖3B、圖3C)。本研究表明干擾THP-1細(xì)胞內(nèi)STAT1， EV71感染抑制STAT1的入核、轉(zhuǎn)錄，且STAT1缺乏使EV71復(fù)制降低，這與已報(bào)道的STAT1缺乏，對EV71的易感性增加不同[12]，猜測原因可能為THP-1細(xì)胞是免疫細(xì)胞有關(guān)，也有可能其他分子、信號通路參與其中，此信號通路并不是抑制EV71感染的最有效通路。研究表明AKT/IRF3信號通路產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素及抗病毒基因成為水性口炎病毒、新城疫病毒和單純皰疹病毒等病毒性疾病的潛在治療角色[3]，許多信號通路被報(bào)道參與抑制EV71的復(fù)制如：RLR信號通路中USP4蛋白的泛素化[13]、p38MA PK信號通路[14]、NF-KB信號通路[15]、TOLL樣受體3等[16]。而JAK/STAT信號通路在EV71感染中的具體詳細(xì)分子機(jī)制、信號通路有待進(jìn)一步研究。

EV71病毒基因的變異性使手足口病的防控形勢更加嚴(yán)峻，應(yīng)用RNAi技術(shù)阻斷STAT1入核，有望為EV71的治療提供新的途徑。