牛子長(zhǎng)，覃小燕 ，韓曉玲 ，李 潔 ，韋 秋 ，陳 璐 ，毛浩萍

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

丹紅注射液是由丹參和紅花制成的常用中藥復(fù)方制劑，臨床上廣泛用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為丹參具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰之功效；紅花具有活血化瘀，散濕去腫的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明丹紅注射液具有抑制心肌細(xì)胞肥大、抗炎、抗凝抑栓、抑制急性腦梗死神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用[2-7]。

心肌缺血再灌注損傷中常見氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激引起的線粒體損傷是介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的主要原因之一。氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧簇（ROS）含量增加，從而導(dǎo)致線粒體受損，線粒體膜電位下降，去極化產(chǎn)生，從而啟動(dòng)心肌細(xì)胞凋亡程序[8]。有研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液具有上調(diào)凋亡抑制基因bcl-2的作用，提示丹紅注射液具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用[9]。線粒體途徑作為細(xì)胞凋亡的主要通路之一，其是否參與調(diào)控丹紅注射液抗心肌細(xì)胞凋亡過程還不得而知。為了進(jìn)一步清楚和完善丹紅注射液抗心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了丹紅注射液抗異丙腎上腺素 （ISO）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用，從線粒體損傷角度研究了丹紅注射液的抗心肌細(xì)胞凋亡作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 H9c2心肌細(xì)胞來自美國ATCC細(xì)胞率。

1.2 實(shí)驗(yàn)受試藥物和試劑 丹紅注射液（批號(hào)：13062020，菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司）；DMEM，（Hyclone）；胎牛血清（FBS，Biological Industries）；抗生素（青霉素，鏈霉素，Hyclone）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；PBS（Neuronbc）；0.25%胰蛋白酶（Biological Industries）；異丙腎上腺素（ISO，Sigma公司）；CellROX?Oxidative Stress Reagents、JC-1 Mitochodrial Potential Sensors Kit（Invitrogen）；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（BD）；fluo-3 AM（碧云天）。

1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀FACSAria3（BD）、活細(xì)胞熒光成像儀IncuCyte Zoom（Essen BioSience公司）、激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司以及多功能讀板機(jī) Flexstation（MD）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移到含有5mL完全培養(yǎng)液（90%DMEM+10%FBS+1%雙抗）的25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合90%左右時(shí)，傳代。24 h后更換含1%胎牛血清的全培基，使其細(xì)胞生長(zhǎng)同步化24 h。加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物處理24 h。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組、模型組 10μmol/L ISO、10μmol/L ISO+丹紅注射液（20、200μL/L）劑量組。

2.2 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響 PBS洗滌細(xì)胞3次后，每孔細(xì)胞分別加入200μL試劑盒自帶緩沖液，分別加入Annexin V和PI，避光孵育細(xì)胞30min。加入500mL緩沖液后經(jīng)180目尼龍網(wǎng)過濾后立即上機(jī)檢測(cè)。凋亡細(xì)胞百分比取第4象限細(xì)胞數(shù)值。

2.3 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞線粒體膜電位去極化的影響 細(xì)胞以3×104個(gè)/mL的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μL細(xì)胞懸液，24 h后更換含1%FBS的培基，使其細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。24 h后棄去上清，加入JC-1（終濃度為10μmol/L）50μL/孔。37℃孵育20min。DMEM沖洗細(xì)胞3次，最后1次加入100μL DMEM，Incucyte Zoom中拍照，使之作為基準(zhǔn)值。棄去DMEM，加入藥物。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組、模型組ISO10μmol/L、ISO10μmol/L+丹紅注射液（20、200μL/L）劑量組。Incucyte Zoom中拍照，觀察紅綠熒光的變化。

2.4 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響 細(xì)胞內(nèi)活性氧通過CellROX?Oxidative Stress Reagents試劑盒檢測(cè)。PBS沖洗細(xì)胞2次，3.7%甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，0.1%曲拉通細(xì)胞打孔5min，加入終濃度為5μmol/L的活性氧檢測(cè)試劑，37℃孵育30min。然后加入DAPI（稀釋比例=1∶100）孵育15min。共聚焦拍照分析熒光強(qiáng)度。

2.5 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè) 使用Fluo-3，AM ester試劑檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。細(xì)胞給藥24 h后PBS沖洗3次，使用含5μmol/L Fluo-3 AM ester試劑的細(xì)胞培養(yǎng)液37℃孵育30min。PBS沖洗細(xì)胞3次后使用多功能讀板機(jī)，激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)526 nm讀取熒光光度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（1.33%±0.42%）相比，用ISO處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率（5.13%±0.15%）顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示ISO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡成功。加入20、200μL/L丹紅注射液后，細(xì)胞凋亡率分別下降為4.23%±0.15%和2.37%±0.38%，提示丹紅注射液具有抑制ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的作用，見圖1。

圖1 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響（n=3）Fig.1 Effect of Danhong injection on H 9c2 cells apoptosis induced by ISO（n=3）

3.2 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞線粒體膜電位去極化的影響 JC-1是一種檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針。當(dāng)線粒體膜電位去極化，JC-1熒光由紅變綠。線粒體膜電位發(fā)生去極化時(shí)顯示綠色熒光強(qiáng)度增加。因此本實(shí)驗(yàn)選擇JC-1作為檢測(cè)丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)線粒體膜電位改變的指標(biāo)。數(shù)據(jù)表明，給予ISO后，H9c2細(xì)胞的綠色熒光/紅色熒光比值顯著升高。然而，丹紅注射液顯著降低綠色熒光與紅色熒光強(qiáng)度比，見圖2。結(jié)果提示丹紅注射液可抑制ISO誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化。

3.3 丹紅注射液對(duì)H9c2細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的影響CellROX?氧化應(yīng)激試劑是一種檢測(cè)活性氧的熒光探針試劑。圖3顯示了典型的活性氧染色激光共聚焦顯微鏡圖片。ISO作用24 h后，心肌細(xì)胞中活性氧水平顯著增加。和ISO組相比，共同給藥丹紅注射液后可顯著降低活性氧含量，見圖3。

3.4 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的影響 10μmol/L ISO顯著升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（與對(duì)照組相比，P＜0.01）。200μL/L丹紅注射液顯著抑制ISO誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高（與ISO 組相比，P＜0.01）。

圖2 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H 9c2細(xì)胞線粒體膜電位的影響（n=3）Fig.2 Effect of Danhong injection on m itochondrial transmembrane potential in H 9c2 cells induced by ISO（n=3）

圖3 激光共聚焦法檢測(cè)丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H 9c2細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響（n=3）Fig.3 Effectof Danhong injection on ROS induced by ISO in H 9c2 cellsby confocalm icroscopy（n=3）

4 討論

圖4 丹紅注射液對(duì)ISO誘導(dǎo)的H 9c2細(xì)胞鈣離子含量的影響（n=3）Fig.4 Effectof Danhong injection on Ca2+levelH 9c2 cells induced by ISO（n=3）

丹紅注射液是一種臨床應(yīng)用廣泛的中藥制劑，其較好的心腦血管系統(tǒng)保護(hù)療效得到了許多學(xué)者的肯定并已應(yīng)用于缺血性腦卒中、冠心病心絞痛、心肌缺血等的臨床治療[10-12]。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)丹紅注射液丹的研究更多的是集中在其臨床療效觀察。丹紅注射液對(duì)心腦血管系統(tǒng)保護(hù)作用的具體機(jī)制研究主要集中在抗炎作用、抗氧化作用、降血脂以及神經(jīng)保護(hù)和心肌保護(hù)等幾個(gè)方面[13-17]。在抗細(xì)胞凋亡方面，雖然丹紅注射液抗腦神經(jīng)元凋亡和抗心肌細(xì)胞凋亡作用均有見報(bào)道，但是以抗腦神經(jīng)凋亡機(jī)制研究較多。丹紅注射液抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制相關(guān)研究相對(duì)較少，認(rèn)為其抗心肌細(xì)胞凋亡與其抑制凋亡相關(guān)蛋白bax、caspase3的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)有關(guān)[18-19]，其抗心肌細(xì)胞凋亡作用與線粒體損傷的相關(guān)性仍不明確。因此，本研究采用ISO為誘導(dǎo)因素，從線粒體損傷及細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載角度進(jìn)一步研究了其抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

交感神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是β腎上腺素受體[20-22]，在心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演了極其重要的角色。心血管系統(tǒng)疾病過程中常伴隨發(fā)生心室重構(gòu)，心臟為維持有效循環(huán)量、保持血壓穩(wěn)定，在心輸出量減少時(shí)激活交感神經(jīng)系統(tǒng)（SNS）分泌腎上腺素和去甲腎上腺素，從而激活β腎上腺素受體直接或間接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大或凋亡，反過來加重心室重構(gòu)的發(fā)生。因此，抗β腎上腺素受體激活藥物的發(fā)現(xiàn)對(duì)心血管系統(tǒng)疾病的有效防治具有重要意義。有報(bào)道稱β-AR在心臟中表達(dá)三種亞型：β1-，β2-AR和近期發(fā)現(xiàn)的β3-AR。其中β1-，β2-AR研究最為廣泛。它們和激動(dòng)性G蛋白Gs或抑制性G蛋白Gi結(jié)合，在心肌功能變化的進(jìn)程中發(fā)揮著不同的作用[23]。有研究表明β1-AR和Gs結(jié)合，激活A(yù)C-cAMP-PKA-Ca2+信號(hào)通路。相比之下，β2-AR和Gs，Gi都能結(jié)合。β2-AR和Gs結(jié)合，作用類似于β1-AR，激活A(yù)C-cAMP-PKA-Ca2+信號(hào)通路。然而，β2-AR和Gi結(jié)合，通過PI3K-AKt信號(hào)通路發(fā)出心肌細(xì)胞生存信號(hào)[24-26]。異丙腎上腺素ISO，作為一種β受體激動(dòng)劑，廣泛用于心肌肥大、凋亡的誘導(dǎo)劑[27]。ISO可通過直接或間接激動(dòng)腎上腺素受體產(chǎn)生與交感神經(jīng)興奮相似的效應(yīng)。ISO對(duì)β受體具有較強(qiáng)的激活作用，表現(xiàn)為正性肌力和正性頻率作用，可使心肌收縮力增強(qiáng)，心率加快，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大以及心肌細(xì)胞凋亡。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)經(jīng)10μmol/L ISO作用后，細(xì)胞凋亡率顯著上升，說明模型制備成功。丹紅注射液顯著降低ISO誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率，提示丹紅注射液具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞凋亡，也叫細(xì)胞程序性死亡，是指細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下為了維持自我穩(wěn)態(tài)，在特定基因嚴(yán)格控制下發(fā)生的一種主動(dòng)死亡現(xiàn)象。心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生于多種心血管系統(tǒng)疾病中，研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡參與了心力衰竭、心肌梗死和心律不齊等多種心臟相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[28-30]。細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制有經(jīng)典線粒體損傷（內(nèi)源性途徑）和死亡受體活化（外源性途徑）介導(dǎo)的傳導(dǎo)通路細(xì)胞凋亡以及近來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡[31]。其中，線粒體損傷是最主要的細(xì)胞凋亡誘因[8]。細(xì)胞在受到應(yīng)激或胞外凋亡誘導(dǎo)信號(hào)刺激時(shí)，線粒體損傷凋亡途徑被激活，導(dǎo)致促凋亡蛋白Bax/抗凋亡蛋白Bcl-2比值升高，引起細(xì)胞線粒體膜去極化，激活caspase-3從而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。采用線粒體膜電位試劑JC-1，發(fā)現(xiàn)10μmol/L ISO顯著引起H9c2細(xì)胞線粒體膜電位去極化，而丹紅注射液能顯著抑制ISO誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位下降（P＜0.05），提示丹紅注射液的抗H9c2細(xì)胞凋亡與其抑制細(xì)胞線粒體損傷有關(guān)。

此外，有研究報(bào)道細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑可能由細(xì)胞氧化應(yīng)激、鈣超載等因素誘發(fā)從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降，線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致包括動(dòng)脈粥樣硬化、急性心肌梗死和心力衰竭等多種心血管疾病發(fā)生的重要途徑之一。氧化應(yīng)激不僅可以通過增加脂質(zhì)過氧化水平、降低抗氧化防御機(jī)制導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜通透性增加，還可以通過直接損傷線粒體促使凋亡誘導(dǎo)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[32]。線粒體在有氧代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物活性氧簇過量會(huì)引起線粒體損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Ca2+是一種細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，鈣離子濃度升高也是引起線粒體膜去極化的因素之一[33]。因此，研究進(jìn)一步研究了丹紅注射液對(duì)ISO引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧及鈣超載的影響。研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液對(duì)ISO引起的H9c2細(xì)胞凋亡具有顯著抑制作用，這與其抑制線粒體膜電位下降、抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高有關(guān)。