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        芪藶強(qiáng)心膠囊中酚酸類成分在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究*

        2019-08-27 02:05:02張富賡朱明丹張少?gòu)?qiáng)杜武勛肖學(xué)鳳
        天津中醫(yī)藥 2019年8期
        關(guān)鍵詞:血漿

        張 瑜,張富賡,朱明丹,張少?gòu)?qiáng),杜武勛,肖學(xué)鳳

        (1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617;2.天津市環(huán)湖醫(yī)院,天津 300350;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300150)

        近年來(lái),慢性心力衰竭的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),成為心血管疾病患者的主要死亡原因之一[1]。芪藶強(qiáng)心膠囊首次收載于2015版《中國(guó)藥典》中,具有益氣溫陽(yáng),活血通絡(luò),利水消腫的功效。多中心臨床試驗(yàn)研究顯示芪藶強(qiáng)心膠囊聯(lián)合西藥能夠提高慢性心力衰竭患者的運(yùn)動(dòng)耐力和生活質(zhì)量,降低心血管事件和再住院率[2-3]。丹參為方中臣藥,配伍人參、葶藶子,具有通經(jīng)活血利水的功效。其中丹參的酚酸類化合物是心臟保護(hù)作用的主要活性物質(zhì),具有保護(hù)心肌缺血再灌注損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗血栓及抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理活性[4],作用機(jī)制涉及改善心肌能量代謝、抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激、提高心肌細(xì)胞活力、抑制凋亡等[5-8]。因此,本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)的方法測(cè)定芪藶強(qiáng)心膠囊中臣藥丹參的6種酚酸類活性成分(丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸)的血藥濃度,并研究上述活性成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征,為進(jìn)一步明確芪藶強(qiáng)心膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料和儀器

        HPLC-MS/MS質(zhì)譜儀:采用API 4000 trap液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),SER.N:AR26221101(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,裝備島津LC-20 AD泵、SIL-20 AC恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20 A控制器、CTO-20 A柱溫箱、AnalystSoftware色譜工作站(1.5.2版本)),XS205型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司),Sorvall RC6+型離心機(jī)(美國(guó)Thermoscientific公司),MIKRO 220R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司),Targin VX-02多管蝸旋振蕩器(北京踏錦科技有限公司)。

        芪藶強(qiáng)心膠囊(丹酚酸A0.772mg/g,丹酚酸B 3.987mg/g,丹參素 1.770mg/g,紫草酸 0.337mg/g,迷迭香酸0.354mg/g,原兒茶酸0.050mg/g)[9]購(gòu)自石家莊以嶺藥業(yè)(批號(hào)140805);標(biāo)準(zhǔn)品丹酚酸B(批號(hào)111562-201515,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%),丹參素(批號(hào)110855-201614,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%),迷迭香酸(批號(hào)111871-201505,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%),原兒茶酸(批號(hào)110809-201205,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;丹酚酸A(批號(hào)H1315006,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),紫草酸(批號(hào)H1624050,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司;水為超純水,乙腈、甲酸為色譜純,其他試劑均為分析純。

        SPF級(jí)健康雄性SD大鼠(200~240 g)由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)SCXK(軍)2012-0004,在天津中醫(yī)藥大學(xué)的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本課題經(jīng)過(guò)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):TCMCAEC2015023)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜與質(zhì)譜條件 Agilent ZOBRAX XDB-C18(4.6mm×50mm,3.5μm),柱溫 40℃,流動(dòng)相 0.1%甲酸水溶液(A)-含0.1%甲酸的乙腈溶液(B)梯度洗脫(0.01~0.6min,7%B;0.6~0.8min,7%~15%B;0.8~7.8 min,15%~65%B;7.8~8.8 min,65%~100%B;8.8~9.8min,100%B;9.8~9.81min,100%~7%B;9.81~12min,7%B),流速0.45mL/min,進(jìn)樣量10μL。

        電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式檢測(cè),多反映監(jiān)測(cè)(MRM)掃描方式,噴霧電壓-4 200 V,脫溶液溫度600℃,氣簾氣20 L/min,霧化氣65 L/min,加熱輔助氣55 L/min。6種酚酸類成分質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

        2.2 溶液的配制

        表1 6種酚酸類成分和內(nèi)標(biāo)(IS)的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 M ainmass parametersof six phenolic acidsand internalstandard

        2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 精密稱取丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,分別加二甲基亞砜(DMSO)溶解并稀釋成2mg/mL的儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液適量,混合并用甲醇∶水(1∶1)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋,得到混合標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液質(zhì)量濃度如下:丹酚酸A、原兒茶酸(5、10、25、100、250、1 000、2 500、5 000、1×104ng/mL);丹酚酸 B、紫草酸、迷迭香酸(10、20、50、200、500、2 000、5 000、1×104、2×104ng/mL);丹參素(50、100、250、500、1 000、2 500、1×104、2.5×104、1×105ng/mL),上述儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液均置于4℃儲(chǔ)存。

        2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量,加甲醇∶乙腈(1∶1)溶解搖勻,配制成濃度 100 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液(IS),置于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3 血漿樣品處理 取大鼠血漿樣品50μL,依次加入5μL標(biāo)準(zhǔn)溶液(50%甲醇水)、10μL維生素C(1.4 mg/mL-100%H2O)和 150μL IS溶液,渦旋30 s,離心 10min(4 ℃ 15 000 r/min),取上清液 10μL進(jìn)樣分析。

        2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

        2.4.1 專屬性考察 分別取空白血漿(等體積甲醇代替內(nèi)標(biāo)溶液)、空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品(丹酚酸A、原兒茶酸血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL,丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為1ng/mL,丹參素血漿樣品溶液的質(zhì)量濃度為5 ng/mL)及灌胃給予芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液后20min的大鼠血漿樣品,按2.3項(xiàng)處理血漿樣品,并按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,得到空白血漿、空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品和給藥后血漿樣品的色譜圖,結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明:丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸及IS的保留時(shí)間分別為7.42、7.59、4.97、7.41、7.45、6.78 及 8.23min,各酚酸類成分和IS能夠完全分離,不會(huì)受到大鼠血漿樣品中雜質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,方法專屬性良好。

        2.4.2 線性關(guān)系考察 取大鼠空白血漿50μL,加入混合標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液,得到質(zhì)量濃度為0.5、1、2.5、10、25、100、250、500、1 000 ng/mL 的丹酚酸 A和原兒茶酸血漿樣品溶液;1、2、5、20、50、200、500、1 000、2 000 ng/mL的丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸血漿樣品溶液;5、10、25、50、100、250、1 000、2 500、1×104ng/mL的丹參素血漿樣品溶液。根據(jù)2.3項(xiàng)處理血漿樣品,并按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表2。

        2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度考察 取大鼠空白血漿,加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,得到丹酚酸 A(1、25、800 ng/mL),丹酚酸 B(2、50、1 600 ng/mL),丹參素(10、250、8 000 ng/mL),紫草酸(2、50、1 600 ng/mL),迷迭香酸(2、50、1 600 ng/mL)及原兒茶酸(1、25、800 ng/mL)低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品(QC),根據(jù)2.3項(xiàng)處理血漿樣品,并按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。于同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定3 d,計(jì)算日間精密度,并測(cè)定均值與真實(shí)值的相對(duì)誤差,計(jì)算準(zhǔn)確度。精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示,準(zhǔn)確度以相對(duì)誤差(RE)表示,結(jié)果見(jiàn)表3。在上述3個(gè)質(zhì)量濃度下,各成分日內(nèi)和日間精密度的RSD均<15%,且準(zhǔn)確度的RE在±15%之間,符合生物樣品測(cè)定的要求。

        圖1 空白血漿(1)、空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品(2)和灌胃1.3g/kg芪藶強(qiáng)心膠囊后20m in的含藥血漿(3)的HPLC-MS/MS色譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS chromatogram of blank p lasma(1),blank p lasma+reference substances(2),and plasma samples after oraladm inistration of1.3 g/kg QiliQiangxin Capsule at20m in(3)

        表2 6種酚酸類成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍和定量下線(LLOQ)Tab.2 Regression equation,correlation coefficient(r),linearity range and LLOQ of six phenolic acids

        2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)與回收率考察 取上述低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品,根據(jù)2.3項(xiàng)處理血漿樣品,并按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,記錄成分峰面積(A);另取甲醇水溶液代替空白血漿,其余操作如上,得到成分峰面積(B);另取大鼠空白血漿,根據(jù)2.3項(xiàng)處理血漿樣品后加入QC樣品,進(jìn)樣分析,記錄成分峰面積(C),A和B的比值為基質(zhì)效應(yīng),A和C的比值為回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。各成分和IS的基質(zhì)效應(yīng)的范圍在80.5%~104%,回收率的范圍在81.0%~103%。

        2.4.5 穩(wěn)定性考察 取上述低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品,各6份,考察樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h(樣品處理后穩(wěn)定性),室溫放置24 h(短期穩(wěn)定性),在-20℃條件下凍融3次(凍融穩(wěn)定性)及在-80℃條件下放置30 d(長(zhǎng)期穩(wěn)定性)的穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)表4。血漿中6種酚酸類成分穩(wěn)定性的RSD均<15%,說(shuō)明樣品在上述條件下放置均穩(wěn)定。

        2.5 藥動(dòng)學(xué)研究 取6只雄性SD大鼠,實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h,自由飲水。灌胃給予芪藶強(qiáng)心膠囊混懸液(0.5%CMC-Na配制成混懸液),給藥劑量1.3 g/kg,于給藥后 0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h 經(jīng)目?jī)?nèi)眥靜脈叢取血 0.5mL,置于肝素鈉抗凝管中,在12 000 r/min的條件下離心10min,分離血漿,置于-20℃的冰箱中保存待測(cè),測(cè)定前根據(jù)2.3項(xiàng)處理血漿樣品。大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后血漿中6種酚酸類成分(丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸及原兒茶酸)的藥時(shí)曲線如圖2。采用DAS 3.0軟件非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)果見(jiàn)表5。

        表3 血漿樣品中6種酚酸類成分的精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)和回收率(n=6)Tab.3 Precision,accuracy,matrix effectand recovery of six phenolic acids in plasma sam ples(n=6)

        3 討論

        本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-MS/MS方法同時(shí)測(cè)定大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后,血漿中丹參的6種酚酸類活性成分(丹酚酸A、丹酚酸B、丹參素、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶酸)的血藥濃度,經(jīng)方法學(xué)考察符合生物樣品測(cè)定的要求,可用于生物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)初期對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]酚酸類成分在負(fù)離子模式下響應(yīng)良好,本實(shí)驗(yàn)對(duì)正、負(fù)離子兩種掃描方式下待測(cè)物的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示在負(fù)離子模式下靈敏度更高,可以獲得穩(wěn)定的[M-H]-,因此選用負(fù)離子模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)色譜條件優(yōu)化時(shí),酚酸類成分檢測(cè)的流動(dòng)相多為加入酸的水-乙腈系統(tǒng)[12],因此實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸水溶液(A)-含0.1%甲酸的乙腈溶液(B)為流動(dòng)相,結(jié)果顯示各待測(cè)物分離效果最佳,色譜峰峰形較好。

        表4 血漿樣品中6種酚酸類成分的穩(wěn)定性(n=6)Tab.4 Stability of six phenolic acids in plasma samples under differentstorage conditions(n=6)

        表5 大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后6種酚酸類成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)Tab.5 PK parametersof six phenolic acidsafter oral adm inistration ofQiliQiangxin Capsule(n=6)

        圖2 大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后血漿中6種酚酸類成分的藥時(shí)曲線(n=6)Fig.2 M ean concentration-time profilesof six phenolic acidsafter oraladm inistration of QiliQiangxin Capsule(n=6)

        本實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)丹酚酸A,丹酚酸B,丹參素,紫草酸,迷迭香酸,原兒茶酸均存在明顯的雙峰現(xiàn)象,表明芪藶強(qiáng)心膠囊中上述酚酸類成分在體內(nèi)可能通過(guò)肝腸循環(huán)進(jìn)行重吸收。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道大鼠灌胃丹參提取物后,酚酸類成分吸收表現(xiàn)為單峰[13-14]或雙峰[15-16],而復(fù)方中藥芪藶強(qiáng)心膠囊成分復(fù)雜,且酚酸類成分存在同系物轉(zhuǎn)化,丹酚酸B可通過(guò)水解掉一分子丹參素成為紫草酸,再脫羧轉(zhuǎn)化成丹酚酸A,而丹酚酸A可進(jìn)一步降解成為丹酚酸C和異丹酚酸C[17],另在生物體內(nèi)大分子的丹酚酸A、丹酚酸B和迷迭香酸可轉(zhuǎn)化成小分子丹參素[18],因此本實(shí)驗(yàn)藥時(shí)曲線呈現(xiàn)雙峰吸收現(xiàn)象。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示:大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后,血漿中6種酚酸類成分的達(dá)峰時(shí)間(Tmax)在10~40min內(nèi),半衰期(t1/2)在3.34~8.38 h,呈現(xiàn)吸收快、消除亦快的特點(diǎn)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)血藥達(dá)峰濃度(Cmax)和血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-∞)能夠評(píng)價(jià)藥物的吸收程度和體內(nèi)暴露情況。大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后,血漿中酚酸類活性成分的Cmax和AUC0-∞從大到小排序依次為丹酚酸B>丹參素>紫草酸>迷迭香酸>原兒茶酸>丹酚酸A,其中丹酚酸B的Cmax(502 ng/mL)和AUC0-∞(980.47 h·ng/mL)最高,說(shuō)明其吸收程度和體內(nèi)暴露情況優(yōu)于方中其他活性成分。既往研究報(bào)道丹酚酸B經(jīng)大鼠口服后能夠迅速吸收并轉(zhuǎn)化成丹參素,因此丹參素在受試者體內(nèi)具有較高的系統(tǒng)暴露水平[19-21]。但本研究中表明大鼠灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊后,血漿中丹酚酸B的系統(tǒng)暴露水平明顯高于其它成分,原因可能與芪藶強(qiáng)心膠囊中丹酚酸B的含量(3.987mg/g)較高有關(guān)[9]。另一方面,丹酚酸B對(duì)心肌梗死具有保護(hù)作用,并能夠明顯改善心肌缺血再灌注損傷,對(duì)心血管系統(tǒng)具有顯著的保護(hù)作用[22]。另外,課題組前期對(duì)芪藶強(qiáng)心膠囊含量測(cè)定結(jié)果顯示酚酸類成分的含量從大到小排序依次為[9]:丹酚酸B>丹參素>丹酚酸A>迷迭香酸>紫草酸>原兒茶酸,而本研究中丹酚酸A的Cmax(8.96 ng/mL)和AUC0-∞(21.40 h·ng/mL)最低,其原因可能為丹酚酸A在正常機(jī)體內(nèi)的吸收情況較差,或通過(guò)甲基化和葡萄糖醛酸化快速生成小分子代謝產(chǎn)物有關(guān)[23]。綜上,本實(shí)驗(yàn)對(duì)芪藶強(qiáng)心膠囊中臣藥丹參的6種酚酸類活性成分的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行研究,闡述藥物的體內(nèi)過(guò)程,為進(jìn)一步確定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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