張嬌，于紫燕，趙江月

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110005）

肌節(jié)同源盒基因同系物2（msh homobox 2，Msx2）作為肌節(jié)同源框基因家族的一員，其編碼的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白可調(diào)控細(xì)胞的存活與凋亡［1］。它多表達(dá)在間充質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞的交界處以及細(xì)胞增殖的區(qū)域，在體內(nèi)控制著細(xì)胞的增殖和分化，與心血管、骨骼、眼耳鼻等組織發(fā)育密切相關(guān)，Msx2的表達(dá)異?；蛲蛔儠?huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良影響［2-3］。

在眼發(fā)育學(xué)研究領(lǐng)域，國(guó)外有研究［4］結(jié)果顯示，在Msx2轉(zhuǎn)基因鼠中發(fā)現(xiàn)小眼球畸形及視網(wǎng)膜發(fā)育缺陷。先前的研究［5］中也發(fā)現(xiàn)Msx2表達(dá)異常，通過(guò)抑制FoxE3基因并上調(diào)Prox1的表達(dá)來(lái)調(diào)控晶狀體的發(fā)育。同時(shí)，敲除Msx2基因可通過(guò)激活Casp3/Casp8凋亡信號(hào)通路，引起晶狀體組織中凋亡增加［6］。晶狀體細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的機(jī)制之一，因此，把Msx2作為靶因子導(dǎo)入晶狀體上皮細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖和分化，觸發(fā)凋亡，可能成為基因治療晶狀體及白內(nèi)障相關(guān)疾病的一個(gè)突破性進(jìn)展。

本研究利用基因開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Tet-on），擬建立由doxycycline調(diào)控表達(dá)的Msx2誘導(dǎo)細(xì)胞株，探索其差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），為進(jìn)一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)組選取doxycycline誘導(dǎo)表達(dá)Msx2的Alpha-TN4細(xì)胞株M8；空載體細(xì)胞株T9作為對(duì)照。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)

細(xì)胞株M8空載體T9在含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)doxycycline（1 μg/mL）處理后，24 h后共聚焦熒光顯微鏡觀察，并收集細(xì)胞。

1.3 蛋白提取及濃度測(cè)定

培養(yǎng)的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入適量（200 μL/60 mm皿）裂解液，細(xì)胞刮收取蛋白至EP管每次超聲15 s，重復(fù)5次，放置30 min，4 ℃離心12 000 r/min，15 min，取上清?？捡R斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（北京吉美生物有限公司）測(cè)定樣本液蛋白濃度。

1.4 二維凝膠電泳

配制CyDye DIGE工作液（400 pmol/μL），根據(jù)蛋白定量結(jié)果，標(biāo)本及1份混合內(nèi)標(biāo)各取50 μg加入1 μL濃度為400 pmol/μL的CyDye DIGE染料，避光。漩渦震蕩，徹底混合，12 000g4 ℃離心10 min，收集底部標(biāo)記混合物，在黑暗中冰上反應(yīng)30 min。加入1 μL 10 mmol/L賴氨酸終止標(biāo)記反應(yīng)。充分混合，在黑暗中置于冰上10 min。每份樣品加入同體積的補(bǔ)充液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、2%DTT、2% IPG Buffer），用再水化液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、18 mmol/L DTT、2% CHAPS、0.5% IPG Buffer）將樣品體積補(bǔ)至340 μL，將18 cm IPG膠條（pH 3～pH 10，NL）置于膠條槽內(nèi)，上樣后在IPGphor固相pH梯度等電聚焦儀上行等電聚焦。整個(gè)過(guò)程避光。灌制12%SDS-PAGE膠，脫氧并保證膠面平齊。將IPG膠條置放在兩低熒光玻璃板間的凝膠面上，用0.5%低融點(diǎn)瓊脂糖溶液包埋。恒溫20 ℃，行SDS-PAGE電泳（15 mA/膠，30 min；30 mA/膠，4 h）。整個(gè)過(guò)程避光，最后行考馬斯亮藍(lán)染色。

1.5 掃描及圖像分析

電泳所得凝膠用MilliQ沖洗后用Typhoon 9400熒光掃描儀在不同激發(fā)光下掃描成像，所使用波長(zhǎng)如 下：Cy2-488/520，Cy3-532/580，Cy5-633/679。所 得的蛋白質(zhì)組圖譜用DeCyder 2-D凝膠圖像分析軟件進(jìn)行檢測(cè)、自動(dòng)分析，光斑體積的差異作為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組蛋白表達(dá)水平變化的衡量指標(biāo)，采用Mann WhitneyU-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立由doxycycline誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)Msx2的鼠晶狀體上皮細(xì)胞株

經(jīng)過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)后，G418篩選出明顯由doxycycline調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)Msx2-GFP的Alpha-TN4細(xì)胞株，為M8克隆。同時(shí)，以空載體細(xì)胞株T9作為陰性對(duì)照。細(xì)胞株M8在無(wú)doxycycline存在的條件下不表達(dá)Msx2-GFP，在加入doxycycline（1 μg/mL）10 h后，Msx2-GFP開(kāi)始有微量表達(dá)，隨著時(shí)間增加，Msx2-GFP的表達(dá)量隨之增高。細(xì)胞株M8和T9在doxycycline（1 μg/mL）處理24 h后，以共聚焦顯微鏡檢測(cè)可見(jiàn)細(xì)胞株M8有Msx2-GFP明顯表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 Doxycycline處理24 h后誘導(dǎo)細(xì)胞株M8及T9 ×100Fig.1 Induction of M8 and T9 cell lines by a 24-h doxycycline treatment ×100

2.2 二維電泳分析M8及T9細(xì)胞株蛋白質(zhì)

由誘導(dǎo)的細(xì)胞株M8和空載體T9陰性對(duì)照樣品分別獲得二維凝膠電泳圖譜，每組樣品重復(fù)3次。經(jīng)圖像分析分別在實(shí)驗(yàn)組M8檢測(cè)到5 460個(gè)點(diǎn)，對(duì)照組T9檢測(cè)到5 389個(gè)點(diǎn)。其中M8與T9之間差異點(diǎn)有31個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖2 二維電泳分析晶狀體上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis of lens epithelial cell proteins

2.3 RNA微陣列分析和array結(jié)果的分析

對(duì)M8及T9 2組細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)微陣列分析。通過(guò)SAS統(tǒng)計(jì)軟件篩選DEGs。結(jié)果顯示，在Alpha-TN4細(xì)胞系中存在712個(gè)多于2倍的表達(dá)變化的DEGs，其中454個(gè)基因被上調(diào)，258個(gè)基因被下調(diào)。在下調(diào)的基因中，Col3α1基因下調(diào)明顯，見(jiàn)圖3。對(duì)2組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，檢測(cè)到M8組mRNA的相對(duì)表達(dá)量為7.91±0.35，T9組mRNA的相對(duì)表達(dá)量為4.08±0.26。Col3α1表達(dá)量明顯下降，此結(jié)果與上述結(jié)論保持一致。

圖3 M8及T9細(xì)胞株DEGsFig.3 Differentially expressed genes in M8 and T9 cells

3 討論

Msx2是新近發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。以往研究［7-8］多集中在Msx2對(duì)心血管、骨骼等組織發(fā)育的影響上，本研究利用基因開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Tet-on），首次建立由doxycycline調(diào)控表達(dá)的Msx2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞株。該系統(tǒng)利用改良的大腸桿菌E.coli的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，靶基因的表達(dá)受四環(huán)素的衍生物doxycyclin精確調(diào)節(jié)，故具有低毒性、特異性、高敏感性，且不影響細(xì)胞內(nèi)其他基因活性的特點(diǎn)［9］。在誘導(dǎo)細(xì)胞株中，Msx2受doxycycline的精確調(diào)節(jié)，使誘導(dǎo)細(xì)胞株建系成功。Msx2誘導(dǎo)細(xì)胞株的建立為研究Msx2功能提供了良好的細(xì)胞模型。

本研究采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和方法，對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞株M8和陰性對(duì)照細(xì)胞株T9蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析和比較，檢測(cè)差異明顯的蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)基因表達(dá)微陣列分析，分析出明顯下調(diào)及上調(diào)的基因。并對(duì)其中在Msx2過(guò)表達(dá)細(xì)胞株M8中下調(diào)明顯的Col3α1進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析驗(yàn)證，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Msx2基因的晶狀體上皮細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，Col3α1的表達(dá)量明顯下降，該結(jié)果與基因表達(dá)微陣列分析結(jié)果保持一致。

Col3α1作為一種Ⅲ型膠原，主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，尤其在人的血管內(nèi)膜、肌肉等結(jié)締組織中含量豐富［10］。在晶狀體中，膠原纖維的異常增生會(huì)加速晶狀體上皮細(xì)胞纖維化，加速細(xì)胞移行，從而導(dǎo)致晶狀體渾濁。已知后發(fā)性白內(nèi)障（posterior capsular opacification，PCO）的發(fā)生與晶狀體囊膜的纖維化和基質(zhì)的積聚和收縮有關(guān)［11］。其中晶狀體囊膜由晶狀體上皮細(xì)胞核纖維產(chǎn)生，富含Ⅳ型膠原蛋白，也含有Ⅰ型和Ⅲ型膠原及細(xì)胞外基質(zhì)成分。研究發(fā)現(xiàn)正常情況下Ⅳ型膠原纖維均勻分布于晶狀體囊全層，同時(shí)還存在Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅲ型膠原因具有特異性而使晶狀體囊區(qū)別于眼球內(nèi)其他基底膜組織［12-13］。而膠原纖維以及細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積是PCO發(fā)生的重要病理機(jī)制［14］。本研究中Msx2過(guò)表達(dá)引起的Col3α1下調(diào)可能是晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的一個(gè)潛在機(jī)制，這一發(fā)現(xiàn)為PCO的基因治療提供了新的研究思路。但Msx2與Col3α1之間是否存在直接聯(lián)系，以及Col3α1如何影響Msx2，從而促發(fā)細(xì)胞凋亡，仍需進(jìn)一步研究。