劉媛媛， 孟秀杰， 李麗靜

（1. 唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 河北 唐山063000； 2. 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科， 河北 承德067000）

梅翁退熱顆粒收載于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十七冊[1], 由金銀花、 野菊花、綿馬貫眾、 連翹、 崗梅、 水翁花、 魚腥草等10 味中藥材組成, 具有疏風(fēng)清熱、 解毒利咽、 消癰散結(jié)的功效, 臨床上主要用于風(fēng)熱感冒、 發(fā)熱咳嗽、 咽喉腫痛、 胸脘脹痛、 喉痹、 乳蛾等疾病的治療, 但其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對方中成分進行定量控制, 前期報道僅有對連翹苷含有量進行測定[2]。

中成藥復(fù)方制劑中的有效成分復(fù)雜多樣, 單一成分難以對其質(zhì)量進行全面準(zhǔn)確的評價和控制, 近年來多成分、 多指標(biāo)質(zhì)量評價模式已成為相關(guān)研究的必然趨勢, 但存在部分成分對照品不穩(wěn)定、 價格昂貴等因素, 限制了其普及和推廣。 一測多評法通過測定對照品易得、 質(zhì)量穩(wěn)定的一種成分, 利用中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系建立相對校正因子, 計算其他成分含有量, 從而實現(xiàn)多種成分同時測定, 有效降低了檢驗成本。 因此, 本實驗采用該方法同時測定梅翁退熱顆粒中木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、 連翹酯苷B、 連翹酯苷A、連翹苷、 牛蒡子苷元、 坡模酸的含有量, 以期為該制劑質(zhì)量控制和評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； Waters e2695 型高效液相色譜儀 （美國Waters 公司）； Thermo ODS C18、 Phenomenex BDS C18、 SunFire-C18色 譜 柱； XPE205DR 型 電 子 天 平（十萬分之一, 瑞士Mettler-Toledo 公司）； YQ-620C 型超聲波清洗器（上海易凈超聲波儀器有限公司）。 木犀草苷 （111720-201609）、 木犀草素（111520-201605）、 連翹酯苷B （111811-201603）、連翹酯苷A （111810-201707）、 連翹苷（110821-201816） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；東北貫眾素（12777-70-7）、 牛蒡子苷元（7770-78-7）、 坡模酸（13849-91-7） 對照品均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。 梅翁退熱顆粒（每袋裝15 g,批號171202、 180203、 180401） 購自廣州康和藥業(yè)有限公司。 乙腈為色譜純； 其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.5% 磷酸（B）, 梯度洗脫（0 ～16.0 min, 12.0% A； 16.0 ～41.0 min, 12.0% ～35.0% A； 41.0 ～49.0 min,35.0% ～52.0% A； 49.0 ～55.0 min, 52.0% ～75.0% A； 55.0 ～65.0 min, 75.0% ～12.0% A）；0～24.0 min 在350 nm[3]波長下檢測木犀草苷、 木犀草素, 24.0～32.0 min 在295 nm[4]波長下檢測東北貫眾素, 32.0～49.0 min 在275 nm[5]波長下檢測連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元,49.0～65.0 min 在205 nm[6-7]波長下檢測坡模酸；體積流量0.9 mL/min； 柱溫25 ℃； 進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密各對照品適量, 70%甲醇制成分別含木犀草苷0.498 mg/mL、 木犀草素0.312 mg/mL、 東北貫眾素4.876 mg/mL、 連翹酯苷B 0.574 mg/mL、 連翹酯苷A 1.716 mg/mL、 連翹苷0.852 mg/mL、 牛蒡子苷元0.238 mg/mL、 坡模酸0.702 mg/mL 的貯備液, 精密吸取適量, 70%甲醇制成每1 mL 分別含木犀草苷24.9 μg、 木犀草素15.6 μg、 東北貫眾素243.8 μg、 連翹酯苷B 28.7 μg、 連翹酯苷A 85.8 μg、 連翹苷42.6 μg、牛蒡子苷元11.9 μg、 坡模酸35.1 μg 的溶液,即得。

2.3 供試品溶液制備 取顆粒適量, 研細, 精密稱取約1.0 g, 置于具塞錐形瓶中, 精密加入70%甲醇25 mL, 稱定質(zhì)量, 超聲（300 W、 40 kHz）提取30 min, 放冷, 70% 甲醇補足減失質(zhì)量, 搖勻, 濾過, 即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照顆粒處方和制法,分別制備不含金銀花和野菊花、 綿馬貫眾、 連翹、崗梅的陰性樣品, 按 “2.3” 項下方法制備,即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗 取對照品、 供試品、 陰性樣品溶液, 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定, 結(jié)果見圖1。 由圖可知, 各成分色譜峰分離度良好（＞1.5）, 理論塔板數(shù)均大于4 000, 陰性無干擾。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密稱取各對照品適量,置于同一20 mL 量瓶中, 70% 甲醇制成線性溶液I, 70%甲醇再依次稀釋2、 4、 8、 16、 25 倍, 分別制成線性溶液Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ、 Ⅴ、 Ⅵ, 精密吸取適量, 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸, 結(jié)果見表1, 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.3 精密度試驗 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液, 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次,測得木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、 連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元、 坡模酸峰面 積 RSD 分 別 為 1.03%、 1.11%、 0.61%、0.94%、 0.72%、 0.85%、 1.30%、 0.89%, 表 明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批（批號171202） 顆粒適量, 按“2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液, 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、 連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元、 坡模酸含有量RSD 分 別 為 0.55%、 1.63%、 1.07%、 0.18%、1.29%、 1.21%、 0.86%、 1.37%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批 （批號171202） 供試品溶液, 室溫下于0、 2、 4、 6、 12、16 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定, 測得木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、 連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元、 坡模酸峰面積RSD分別為0.97%、 1.06%、 0.58%、 0.91%、 0.77%、0.82%、 1.35%、 0.94%, 表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的同一批（批號171202） 顆粒6 份, 每份約0.5 g, 加入對照品溶液[木犀草苷（0.267 mg/mL） 1.0 mL、木犀草素（0.199 mg/mL） 1.0 mL、 東北貫眾素（1.031 mg/mL） 3.0 mL、 連翹酯苷B （0.363 mg/mL）1.0 mL、 連翹酯苷A（1.038 mg/mL） 1.0 mL、 連翹 苷 （0.634 mg/mL） 1.0 mL、 牛 蒡 子 苷 元（0.147 mg/mL） 1.0 mL、 坡模酸（0.479 mg/mL）1.0 mL], 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項色譜條件下進樣測定, 計算回收率。結(jié)果, 木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、 連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元、 坡模酸平均加樣回收率分別為 98.54%、 97.29%、100.08%、 98.88%、 99.42%、 99.04%、 96.98%、98.93%, RSD 分別為1.32%、 1.08%、 0.60%、0.94%、 1.16%、 0.79%、 1.42%、 1.22%。

2.6 相對校正因子計算 精密吸取“2.5.2” 項下6 個線標(biāo)溶液, 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定, 以連翹苷為內(nèi)標(biāo), 計算其他7 種成分的相對校正因子fk/s, 公式為= fk/fs= （WkAs） / （WsAk）（Wk為其他成分質(zhì)量濃度, Ak為其他成分峰面積,Ws為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度, As為內(nèi)標(biāo)峰面積）, 結(jié)果見表2。

2.7 耐用性考察

2.7.1 儀器、 色譜柱 考察Agilent 1200、 Waterse2695 型色譜儀, 以及Thermo ODS C18、 Phenomenex BDS C18、 SunFire-C18色譜柱對相對校正因子的影響, 發(fā)現(xiàn)不同儀器、 色譜柱均無明顯影響,RSD 分 別 為 1.35%、 0.71%、 1.26%、 0.52%、1.90%、 1.17%、 0.54%。

2.7.2 體積流量 考察0.8、 0.9、 1.0 mL/min 體積流量對相對校正因子的影響, 發(fā)現(xiàn)不同體積流量均無明顯影響, RSD 分別為1.26%、 0.77%、1.18%、 0.15%、 1.83%、 1.20%、 0.44%。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.8 色譜峰定位 以連翹苷為內(nèi)標(biāo), 考察其他7種成分在不同色譜儀、 色譜柱下與內(nèi)標(biāo)物的相對保留值, 對待測成分色譜峰進行定位, 結(jié)果見表3,可知不同儀器、 色譜柱下相對保留值無明顯差異。

表3 各成分相對保留值Tab.3 Relative retention values of various constituents

2.9 樣品含有量測定 取3 批顆粒 （批號171202、 180203、 180401） 適量, 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定, 分別采用外標(biāo)法和一測多評法計算含有量, 結(jié)果見表4, 可知2 種方法所得結(jié)果無明顯差異, 相對平均偏差（RAD） 均＜2.0%。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g）

3 討論

3.1 流動相優(yōu)化 本實驗考察了不同流動相（乙腈-水[2-3,7-8]、 乙腈-0.5%冰醋酸[3,8]、 乙腈-0.5%磷酸[5-6,8-13]） 對木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元、坡模酸峰形、 分離效果、 基線平穩(wěn)的影響, 同時不斷優(yōu)化流動相比例。 最終確定, 以乙腈-0.5%磷酸為流動相, 按“2.1” 項下比例進行梯度洗脫。

3.2 供試品溶液制備方法篩選 本實驗考察了不同提取溶劑 （甲醇[2-3,6]、 70% 甲醇[3,5]、 乙醇[7]、70%乙醇[3]） 對木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、 連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元、 坡模酸提取率的影響, 發(fā)現(xiàn)以70% 甲醇為提取溶劑時, 各成分綜合提取率最佳。 在此基礎(chǔ)上,又考察了不同提取方式（超聲提取[3,5-8,10]、 加熱回流提取[2,8-9]） 對各成分提取率的影響, 發(fā)現(xiàn)差異不大, 可能與梅翁退熱顆粒生產(chǎn)工藝有關(guān), 結(jié)合檢驗操作便捷性, 選擇超聲提取。 同時, 又對超聲提取時間（15、 30、 45 min） 進行考察。 最終確定, 采用70%甲醇超聲提取30 min 作為供試品溶液制備方法。

4 結(jié)論

本實驗以連翹苷為內(nèi)標(biāo), 建立一測多評法同時測定梅翁退熱顆粒中木犀草苷、 木犀草素、 東北貫眾素、 連翹酯苷B、 連翹酯苷A、 連翹苷、 牛蒡子苷元、 坡模酸的含有量, 可實現(xiàn)該制劑多指標(biāo)成分定量測定的質(zhì)量評價模式, 而且該方法操作簡便,重復(fù)性好, 為其質(zhì)量控制和評價提供科學(xué)依據(jù)。