李昉峻，周其文，漆新華，宋正國(guó)*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191）

鎘（Cd）作為一種毒性極強(qiáng)的重金屬，經(jīng)由水源、食物的攝入可對(duì)人體產(chǎn)生致癌作用或引發(fā)慢性疾病[1]。據(jù)估算，我國(guó)被鎘、砷等污染的耕地近0.12億hm2，僅Cd污染的耕地就高達(dá)533萬(wàn)hm2，點(diǎn)位超標(biāo)率為7.0%。水稻是對(duì)Cd吸收較強(qiáng)的作物之一，也是超過(guò)六成國(guó)人的主糧。甄燕紅等[2]在2007年對(duì)隨機(jī)抽取的91種市售大米的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)Cd超標(biāo)率高達(dá)10%。采用適當(dāng)?shù)拇胧┙档徒橘|(zhì)中（土壤）Cd的有效性，減少水稻根系和籽粒對(duì)Cd的吸收累積[3]，不僅能夠保障水稻安全生產(chǎn)，同時(shí)也能降低因污染造成的糧食減產(chǎn)等后續(xù)影響帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。目前的土壤修復(fù)技術(shù)在解決大面積的農(nóng)田重金屬污染問(wèn)題的同時(shí)存在某些局限性，例如：成本較高，效率低下，貽誤農(nóng)時(shí)等，因此，抑制重金屬在植物中的轉(zhuǎn)移和積累是現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)之一[4]。研究表明，施加外源物質(zhì)如水楊酸、褪黑素、硒、硅、谷胱甘肽、抗壞血酸等可有效緩解植物Cd脅迫[5]。此外，海藻糖（TR）可以保護(hù)蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜在鹽[6]、干旱[7]和低溫[8]等脅迫情況下引起的失活或變性，顯示出高水平耐受性[9]，但對(duì)TR如何影響水稻幼苗Cd吸收的研究鮮有報(bào)道。不過(guò)Duman等[10]的研究中表明，TR對(duì)浮萍（Lemna gibba L.）Cd吸收具有抑制作用，并推測(cè)Cd2+可能與TR分子中的羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而中斷植物對(duì)Cd2+的積累。

TR是由兩個(gè)葡萄糖分子以1，1-糖苷鍵構(gòu)建而成的非還原性二糖，其中雖然有3種可能的海藻糖異構(gòu)體，但目前只有α，α-海藻糖能從生物體中分離出來(lái)并生物合成[11]。這種糖普遍存在于各種各樣的生物中，通常作為能量、碳源、信號(hào)分子存在，當(dāng)它們暴露于各種形式的應(yīng)激時(shí)，會(huì)在許多微生物和無(wú)脊椎動(dòng)物中積累[12]。植物自身合成內(nèi)源性海藻糖的量是有限的[13]，高等植物更是微乎其微，但植物體內(nèi)普遍都含有海藻糖酶，可能正是為了維持體內(nèi)TR水平的平衡[14]。如何利用TR良好的抗逆性來(lái)應(yīng)對(duì)非生物脅迫已是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，André等[15]通過(guò)在煙草植物中過(guò)表達(dá)TR合成基因提高了對(duì)高溫的耐受性。本研究旨在探討TR對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，以期為T(mén)R影響水稻Cd吸收的生理機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用水稻品種為購(gòu)買(mǎi)自湖南隆平種業(yè)有限公司的T優(yōu)705，海藻糖由上海源葉生物科技有限公司提供，所有化學(xué)品均為分析純?cè)噭┘?jí)，其純度均超過(guò)98%。

1.2 水稻培育

將水稻種子置于5%（V/V）的30%過(guò)氧化氫溶液中浸泡10～15 min，用去離子水清洗干凈，均勻鋪在濕潤(rùn)網(wǎng)格育苗盤(pán)上，在恒溫培養(yǎng)箱（28℃，濕度80%）中暗培養(yǎng)48 h進(jìn)行催芽。待種子胚芽露白后將育苗盤(pán)轉(zhuǎn)移至人工氣候室繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)水稻幼苗長(zhǎng)至兩葉一心后轉(zhuǎn)移到含1/10 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的8 L水培箱中進(jìn)行培育，待三葉一心時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗饑餓處理2 d后放入不同Cd-TR濃度的處理液，在500 mL PVC黑色罐中進(jìn)行處理。人工氣候室條件參數(shù)：溫度25±3 ℃，光照時(shí)長(zhǎng)16 h·d-1，空氣濕度60%，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 水稻對(duì)Cd2+的時(shí)間動(dòng)力學(xué)吸收

設(shè)置兩個(gè)處理分別為僅Cd處理且濃度為88.96 μmol·L-1（M4）和含26.43 mmol·L-1海藻糖且Cd濃度為88.96 μmol·L-1（M4+T3）的處理，處理時(shí)間梯度（h）為：1、2、3、5、7、9、11、14、26、29、32、35、39、48。Cd以CdCl2·2.5H2O的形式加入，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 水稻在不同Cd濃度下的吸收動(dòng)力學(xué)

設(shè)置 Cd處理濃度：0（M0）、8.89（M1）、17.79（M2）、44.48（M3）、88.96（M4）μmol·L-1，TR 處理濃度：0（T0）、2.64（T1）、13.21（T2）、26.43（T3）、39.64（T4）、52.85（T5）mmol·L-1，其中M0+T0處理為空白對(duì)照，即CK，處理時(shí)間為18 h。Cd以CdCl2·2.5H2O的形式加入，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 水稻生物量的測(cè)定

處理結(jié)束后，用5 mmol·L-1氯化鈣溶液浸泡幼苗根系15 min，以除去附著在根系表面的Cd2+，然后用去離子水沖洗干凈。

將水稻幼苗分為莖葉、根系兩部分，迅速稱取其鮮質(zhì)量，然后裝入信封，置于烘箱中75℃下烘至恒質(zhì)量。

1.5 鎘、鈣、鎂含量的測(cè)定

將已經(jīng)烘干至恒質(zhì)量的水稻莖葉和根系剪碎并分別稱取0.20 g于聚四氟乙烯消解管中，加入7 mL硝酸在通風(fēng)櫥中靜置12 h，用消解儀（ED54，萊伯泰科，美國(guó)）加熱至110℃消解2.5 h，待其冷卻后各加入1 mL 30%H2O2繼續(xù)于110℃消解1.5 h，然后升溫于180℃蒸發(fā)溶液至0.5 mL左右。將消解管中剩余液體用去離子水定容至25 mL，用ICP-MS（agilent 7500a，USA）測(cè)定樣品中鎘（Cd）、鈣（Ca）、鎂（Mg）的含量。

1.6 葉綠素含量的測(cè)定

將新鮮收取的水稻葉片用去離子水沖洗干凈，用濾紙擦干，剪碎后稱取0.2 g用95%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，避光浸提12 h后，以95%乙醇為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)分別在665 nm測(cè)定吸光值A(chǔ)665并計(jì)算葉綠素a濃度Ca、在649 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)649并計(jì)算葉綠素b濃度Cb。葉綠素a、b濃度相加即得葉綠素總濃度CT進(jìn)而求得葉綠素含量（Chl）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2007和Origin8.6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，并用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TR對(duì)Cd脅迫下水稻鮮質(zhì)量的影響

與試驗(yàn)期間的CK相比，單獨(dú)的TR處理以及單獨(dú)的Cd脅迫對(duì)植株的鮮質(zhì)量沒(méi)有顯著影響（表1）。相對(duì)于CK，M1+T5、M2+T5、M3+T5、M4+T5處理下幼苗莖葉的相對(duì)鮮質(zhì)量分別為88.21%、96.93%、92.94%、98.70%。在所有處理中，根系鮮質(zhì)量均無(wú)明顯變化，應(yīng)當(dāng)是由于處理時(shí)間較短，對(duì)根系生物量未形成明顯影響。與M+T0系列處理的幼苗相比，TR和Cd交互作用的幼苗鮮質(zhì)量有所下降。在相同Cd處理下，不同濃度TR的施用對(duì)水稻鮮質(zhì)量影響較大，相對(duì)于M4+T0而言，M4+T5、M4+T4、M4+T3、M4+T2、M4+T1處理下莖葉鮮質(zhì)量分別降低了11.6%、6.2%、3.2%、1.1%、3.4%。

2.2 水稻幼苗對(duì)Cd2+吸收的時(shí)間動(dòng)力學(xué)特征

不同處理下的水稻幼苗Cd含量隨時(shí)間的變化如圖1所示，結(jié)果表明，M4和M4+T3處理下的水稻幼苗莖葉和根系的Cd含量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，并呈現(xiàn)出兩個(gè)快速吸收期，同時(shí)根系Cd含量明顯高于莖葉。當(dāng)處理時(shí)間≤7 h時(shí)，兩種處理下水稻莖葉對(duì)Cd的吸收差異不大，隨著時(shí)間的增加，M4+T3處理的水稻幼苗對(duì)Cd的吸收速率明顯低于M4處理的，處理時(shí)間為14 h時(shí)，M4處理的水稻幼苗莖葉部分Cd含量是M4+T3處理的1.7倍。當(dāng)處理時(shí)間≥14 h時(shí)，莖葉中的Cd積累速率進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期，處理時(shí)間達(dá)到26 h后，莖葉中的Cd積累速率再次躍升。M4+T3處理的水稻幼苗在處理39 h后逐漸趨于平緩，而M4處理的水稻幼苗仍舊快速吸收Cd，在48 h時(shí)兩種處理的水稻幼苗Cd含量差值達(dá)到最大。此時(shí)，M4+T3處理下的水稻葉片Cd含量比M4的降低了42.0%。

表1 不同濃度外源TR及Cd處理后的水稻鮮質(zhì)量（g·pot-1）Table 1 Fresh weight of rice treated with different concentrations of exogenous trehalose and cadmium（g·pot-1）

水稻根系Cd含量在處理時(shí)間≤11 h時(shí)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，但兩個(gè)處理間無(wú)明顯差異。處理時(shí)間達(dá)到14 h后，M4+T3處理的水稻根系Cd積累趨于飽和，而M4處理的繼續(xù)緩慢增長(zhǎng)并于26 h后逐漸穩(wěn)定。與M4處理的幼苗相比，M4+T3處理的水稻幼苗根系在處理48 h時(shí)降低了24.2%。

2.3 水稻幼苗對(duì)Cd2+吸收的濃度動(dòng)力學(xué)特征

圖1 時(shí)間吸收動(dòng)力學(xué)Figure 1 Time absorption kinetics

圖2 濃度吸收動(dòng)力學(xué)Figure 2 Concentration absorption kinetics

TR和Cd交互作用對(duì)水稻吸收Cd的影響見(jiàn)圖2，水稻幼苗的Cd積累濃度隨著處理液中Cd濃度的增加而增加，且水稻莖葉和根系對(duì)Cd的吸收速率均能良好地?cái)M合米氏方程。根據(jù)動(dòng)力學(xué)方程得到水稻幼苗在不同處理下對(duì)Cd吸收的最大速率和米氏常數(shù)如表2所示，從中可以看出，Cd脅迫下，無(wú)TR處理和含TR處理的根系Vmax值差異較小，而莖葉部分Vmax值差異較大。隨著TR濃度的增大，Vmax值逐漸減小。M+T系列處理的莖葉和根系的吸收速率分別比M+T0系列處理的減少了32.44%～41.4%和4.29%～21.56%。Cd脅迫下經(jīng)TR處理的水稻幼苗在莖葉及根系內(nèi)的Cd吸收速率均呈現(xiàn)一定程度的下降趨勢(shì)，其中以M+T5處理的效果最為明顯。

2.4 TR對(duì)Cd脅迫下水稻幼苗Ca、Mg含量的影響

表3數(shù)據(jù)顯示，M+T0系列處理下的幼苗葉片Ca、Mg含量隨著Cd濃度的增加呈增加趨勢(shì)，同時(shí)根部Ca、Mg含量逐漸減少。與M1相比，M2、M3、M4處理的水稻莖葉Ca含量分別上升了28.4%、52.8%、17.3%，根系則相應(yīng)下降了35.9%、49.2%、51.0%。TR顯著提高了相同Cd處理下幼苗葉片的Ca、Mg含量（P＜0.05）（表3）。在M1、M2、M4 Cd處理下，13.21 mmol·L-1海藻糖對(duì)葉片Ca含量的增幅最大，分別提高了23.65%、22.97%、10.74%，此時(shí)根系Ca含量降低了27.5%、6.9%、11.5%。同時(shí)數(shù)據(jù)表明在M1、M2、M3、M4 Cd處理下，TR對(duì)葉片Mg含量的增幅在16.26%～50.91%、2.43%～26.03%、0.16%～6.08%和4.94%～12.16%之間，根系則降低了 22.6%～42.4%、17.2%～55.0%、10.2%～26.6%和3.0%～3.4%。結(jié)果表明，在Cd脅迫下TR可有效提高水稻葉片內(nèi)Ca、Mg含量。

2.5 TR對(duì)Cd脅迫下水稻葉綠素含量的影響

在處理期間內(nèi)，M0+T系列處理的水稻葉綠素含量與CK相比差異不顯著，而M+T0系列處理的幼苗葉綠素含量伴隨著Cd濃度的增加呈下降趨勢(shì)（圖3）。此外，Cd脅迫下添加TR處理的幼苗葉綠素含量降低幅度較大，且M+T4處理降幅最大，此時(shí)M1+T4、M2+T4、M3+T4、M4+T4處理后的幼苗葉綠素含量與CK相比，分別下降了27.6%、29.9%、36.2%、35.9%。

表2 擬合米氏方程的Cd吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Fitted Michaelis Menten kinetics parameters of cadmium uptake

表3 不同濃度外源TR對(duì)Cd脅迫下水稻Ca、Mg積累的影響（g·kg-1）Table 3 Effects of various concentrations of TR on Ca and Mg accumulation in rice leaves exposed to Cd（g·kg-1）

3 討論

圖3 海藻糖對(duì)葉綠素的影響Figure 3 Effect of trehalose on chlorophyll

植物在極端環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生并積累TR幫助生存[16]，外源TR的應(yīng)用也可以改善某些脅迫下部分植物的生長(zhǎng)狀況，并且已知TR可以保護(hù)植物中蛋白質(zhì)和膜的結(jié)構(gòu)和功能[17]。而關(guān)于對(duì)重金屬的耐受性，植物自身也開(kāi)發(fā)了多種機(jī)制來(lái)維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞金屬穩(wěn)態(tài)[18]。在本試驗(yàn)中，增加外源TR的量可減少水稻幼苗Cd的積累。Cd處理后，各幼苗的株高和根長(zhǎng)并未發(fā)生顯著變化（未顯示數(shù)據(jù)），但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，M+T系列處理的幼苗葉片相繼出現(xiàn)不同程度的萎蔫癥狀，基于這些發(fā)現(xiàn)，推測(cè)可能是由于M+T系列處理的溶液水勢(shì)較低引起。在高滲透壓環(huán)境中，細(xì)胞內(nèi)水分快速流出，同時(shí)通過(guò)積累滲透物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)抗逆性，從而引起細(xì)胞脫水[19-20]。Laetitia等[21]在Cd2+對(duì)擬南芥水分損失影響的研究中提出Cd脅迫能夠抑制植物根系和葉片的伸長(zhǎng)，降低植物鮮質(zhì)量。如表1所示，本研究中水稻莖葉鮮質(zhì)量出現(xiàn)不同程度的下降，特別是M4+T5處理下的水稻幼苗表現(xiàn)最為明顯，其在脅迫5 h后，葉片尖端便出現(xiàn)輕微萎蔫，隨著Cd濃度或TR濃度的降低，這種癥狀得到減輕。

李勤鋒等[22]研究發(fā)現(xiàn)紅蛋植物在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)Cd的吸收呈快速吸收和緩慢吸收兩個(gè)階段，并提出可能與細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)流速率不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻幼苗的Cd含量隨之不斷累積（圖2），水稻莖葉Cd吸收存在兩個(gè)躍升期，在第一個(gè)躍升期Cd的積累速度比較緩慢，可能是由于此時(shí)大部分Cd2+被吸附在根系表面，根系是第一個(gè)受到Cd影響的器官，其表面具有大量負(fù)電荷，作為阻止重金屬進(jìn)入細(xì)胞的第一道屏障，細(xì)胞壁通常能吸附大量的Cd2+[23]，少數(shù)被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入地上部的Cd2+在莖葉部分積累[24]。短時(shí)間刺激下植物可通過(guò)增加清除活性氧的酶的表達(dá)來(lái)降低氧化應(yīng)激[25]或者誘導(dǎo)膜成分發(fā)生變化來(lái)抑制Cd造成的損傷[26]。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻抗氧化水平降低，細(xì)胞膜受損，Cd2+迅速得到累積，這可能是出現(xiàn)第二個(gè)躍升期的原因。由于TR對(duì)膜的保護(hù)特性[27]，在添加了TR的Cd溶液中，水稻幼苗對(duì)Cd的積累得到明顯的抑制。

目前尚未發(fā)現(xiàn)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但已有研究表明Cd2+可通過(guò)Ca2+、Mg2+等特異性較低通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[28]。圖2顯示Cd脅迫下添加TR處理后水稻的Cd濃度明顯降低，由于Cd2+與植物細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)元素如鋅、鐵、鈣、錳等具有相似的化學(xué)性質(zhì)，可通過(guò)有益金屬元素運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)入根部[29]，大量積累并轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部分[30]。同時(shí)由于它們的相互競(jìng)爭(zhēng)作用，在脅迫濃度較高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，Cd2+的吸收也可能受到抑制[31]。從表3可以看出在M系列處理中幼苗葉片Ca、Mg含量隨著Cd濃度的增加相繼提高，同時(shí)根系Ca、Mg含量下降。Peel等[32]提出當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性離子的濃度越高，管壁上負(fù)電荷位點(diǎn)的陽(yáng)離子越容易被交換下來(lái)，促進(jìn)其向上運(yùn)輸。另外，木質(zhì)部中養(yǎng)分是從地下運(yùn)往地上的單向運(yùn)輸，且Ca2+在韌皮部中難以移動(dòng)，所以水稻中幼苗的Ca2+會(huì)出現(xiàn)隨著脅迫程度的增強(qiáng)，Ca、Mg大幅度的從根系轉(zhuǎn)移至莖葉部位的現(xiàn)象。表3中數(shù)據(jù)顯示，TR的添加使得Cd脅迫下的幼苗葉片在有效降低Cd積累的同時(shí)提高了Ca、Mg含量。有研究發(fā)現(xiàn)外源施加的TR通過(guò)氫鍵和磷酸基團(tuán)來(lái)穩(wěn)定生物膜[33]，所以推測(cè)由于TR對(duì)膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)了Ca2+、Mg2+同Cd2+的競(jìng)爭(zhēng)能力，有效地保護(hù)了有益元素轉(zhuǎn)運(yùn)通道，從而減少了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)Cd的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低了植物內(nèi)Cd的含量，且可能通過(guò)增加Ca2+、Mg2+在木質(zhì)部中的移動(dòng)性來(lái)提高葉片內(nèi)的Ca、Mg含量。

Bazzaz等[34]研究認(rèn)為，隨著Cd脅迫濃度的增加，植物葉綠素含量呈下降趨勢(shì)。由于根系是植物吸收水分的一個(gè)重要部位，根系的損傷也將對(duì)植物吸水造成不利影響，并且在脅迫條件下，隨著植物的抗逆性增強(qiáng)，細(xì)胞自由水的相對(duì)量也可能減少。隨著Cd處理濃度的增加水稻幼苗葉綠素含量逐漸下降，試驗(yàn)結(jié)果與Stobart等[35]研究結(jié)果相一致。在Cd溶液中，同時(shí)添加了TR處理后水稻葉綠素含量明顯下降可能是由于植物缺水從而抑制了葉綠素的合成，甚至導(dǎo)致原有葉綠素的分解。

4 結(jié)論

（1）隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻莖葉部分的Cd積累量出現(xiàn)兩個(gè)躍升期，并且TR+Cd處理的幼苗莖葉部分和根系部分的Cd積累都得到了有效抑制。

（2）TR可以有效緩解Cd對(duì)水稻幼苗的脅迫作用，并且在相同Cd濃度下，隨著TR濃度的升高，Cd積累量降低，同時(shí)，Ca、Mg含量有所提升。

（3）在相同Cd濃度處理下，TR的添加引起水稻葉綠素減少，光合作用的降低，會(huì)導(dǎo)致水稻幼苗生物量降低。