彭媛媛，武煊，陶曉奇

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(國家級食品科學與工程實驗教學示范中心(西南大學)，重慶，400715)3(重慶市動物疫病預防控制中心，重慶，401120)

肉類食品富含大量的營養(yǎng)成分，是人們?nèi)粘ｏ嬍硺嫾苤械闹匾M成部分。近年來，隨著市場經(jīng)濟的迅猛發(fā)展和人們生活水平的提高，消費者對各種肉類的需求在不斷上漲[1]。目前市面上可食用肉類品種繁多，但由于供需量不同，不同品種間價格差異大，進而誘使不法商販在肉類及其制品中摻雜使假、以次充好而牟取暴利，這樣的事件屢屢出現(xiàn)。肉類摻假涉及到食品安全及其營養(yǎng)價值等問題，同時也擾亂了市場經(jīng)濟秩序，更直接影響了消費者的健康，尤其是那些對部分食物過敏的消費者[2]。此外，由于伊斯蘭教禁食豬肉，在清真食品中摻雜豬肉更涉及宗教信仰方面的問題[3]。而肉類制品通常經(jīng)過加工處理后，以依靠感官與經(jīng)驗的傳統(tǒng)的肉類形態(tài)學為主的鑒別手段已無法準確鑒別其品質(zhì)。因此，建立快速準確的肉類鑒別檢測方法是十分必要的。

近年來，肉類鑒別檢測主要是在蛋白質(zhì)與核酸水平進行，常用檢測技術包括物理技術、化學技術、電泳技術、DNA鑒定技術以及免疫學技術等[4]?；诘鞍踪|(zhì)的檢測方法對儀器、試劑和樣品處理要求高，存在復雜、昂貴、費時且缺乏特異性等問題。而經(jīng)熱處理后蛋白質(zhì)會發(fā)生變性，其特定表位改變，故基于蛋白質(zhì)的檢測方法往往不適用于經(jīng)熱加工處理的肉制品，而適用于對新鮮肉類的檢測[5]。而因肉制品中蛋白質(zhì)含量多樣化及其干擾因素多變性，導致該鑒定方法的應用存在局限性，而基于DNA的檢測方法更具優(yōu)勢，DNA測序能鑒定出物種所具有的獨特DNA序列，即使是未知樣品也能通過比對數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知的物種信息得到樣品的種類[4]。在DNA水平進行的檢測方法包括：DNA探針雜交和以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的基因檢測技術[6]。PCR檢測技術相比于其他檢測手段更為準確，且靈敏度更高。

但常規(guī)的PCR技術雖能定性檢測不同品種的混合肉類，但卻不能實現(xiàn)對目標物的定量分析。實時熒光PCR(Real-Time PCR)定量檢測是指向反應體系中加入熒光基團，在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱變化，實時監(jiān)測特異性產(chǎn)物的量，最后通過標準曲線目的基因進行定量分析的過程[7]。而Real-Time PCR作為一種以PCR為基礎的檢測技術，在實現(xiàn)定性定量分析的同時，與常規(guī)PCR相比自動化程度更高、動態(tài)范圍更高、特異性更強，并能有效解決PCR污染問題。目前，此項技術已應用于醫(yī)學、農(nóng)學等多個領域，在肉類摻假檢測方面的研究及應用也較為成熟。因此，本文梳理了近幾年Real-Time PCR技術檢測肉類摻雜的研究，旨在為完善食品摻假檢測體系提供有益參考。

1 Real-Time PCR檢測肉類摻假

1.1 Real-Time PCR檢測流程

PCR技術是指在體外酶促合成特異性DNA片段的一種方法，Real-Time PCR技術是在常規(guī)PCR技術基礎上加入熒光染料或標記探針，根據(jù)熒光信號的累積對反應過程進行實時監(jiān)控，以實現(xiàn)對起始模板的精確定量[7]。圖1反映了Real-Time PCR技術基本操作流程，根據(jù)反應中熒光信號的變化可繪制如圖1-A所示的擴增曲線，利用閾值循環(huán)數(shù)(Ct)值和起始拷貝數(shù)可建立如圖1-B所示的標準曲線[8]，通過兩者的對應關系可推斷待測模板起始含量。

圖1 Real-Time PCR技術基本操作流程[4,9]

Fig.1 Real-Time PCR technology basic operation flow

1.2 鑒定肉類品種基因的選擇

Real-Time PCR技術應用于肉類摻假檢測領域的關鍵步驟是根據(jù)檢測目標選擇合適的熒光報告基因并設計特異性引物，基于熒光探針法的Real-Time PCR技術，還需要設計并優(yōu)化探針序列。表1整合了部分常見肉類品種的引物和探針序列，肉類鑒別中的熒光報告基因往往需要有較強的特異性，主要包括線粒體基因組DNA、細胞基因組中重復序列和單拷貝序列。線粒體基因組DNA經(jīng)母體遺傳，其種屬特異性較強，是常用的靶基因，通常不會出現(xiàn)由多個等位基因所致的序列歧義情況[10]。線粒體基因組DNA包括：線粒體12S rRNA[11]、16S rRNA[12]、細胞色素b (Cyt b)[13]以及細胞色素C氧化酶I(COI)[14]等基因。但由于不同組織部位的線粒體DNA含量不一致，定量結果易出現(xiàn)偏差。為使得檢測結果更可靠，含量更穩(wěn)定的細胞基因組也開始作為肉類鑒別的靶基因，包括衛(wèi)星DNA、白細胞介素2前體基因以及生長激素基因等[15]。由表1可知，研究人員往往針對不同檢測體系設計不同的引物和探針，并將其優(yōu)化以得到最佳的反應過程。

表1 Real-Time PCR技術鑒定常見肉類物種的引物及探針序列設計

2 Real-Time PCR在肉類摻假檢測的應用

2.1 熒光探針法

2.1.1 熒光探針法的建立

2.1.1.1 Taqman熒光探針

Taqman熒光探針法又稱雜交探針標記法，利用了引物及探針與靶基因序列的匹配機制，具有高特異性、高適應性和可靠性的特點。如圖2所示，同時加入一對引物和一個水解核苷酸探針于PCR擴增體系，在激光激發(fā)下，可通過體系內(nèi)的熒光信號變化來準確定量模板[17]。

圖2 Taqman實時熒光定量PCR過程示意圖[1]

Fig.2 The diagrammatic drawing of the process of Taqman real-time PCR[1]

2.1.1.2 分子信標

分子信標(molecular beacon)是一種呈環(huán)形發(fā)夾結構的雙標記寡核苷酸探針[7]。如圖3所示，探針最初呈環(huán)狀關閉狀態(tài)，PCR擴增時，探針環(huán)狀區(qū)序列與目標分子模板特異性結合，在激光作用下釋放熒光[17]。

圖3 分子信標結構及釋放熒光過程示意圖[7]

Fig.3 The diagrammatic drawing of molecular beacon structure and the process of releasing fluorescence[7]

2.1.2 熒光探針法的應用

熒光探針法在肉類摻假檢測方面應用較為廣泛，以前基于熒光探針的Real-Time PCR技術多用于檢測單一的目標，隨著科學技術的發(fā)展，Real-Time PCR檢測體系日益改善：逐漸優(yōu)化引物及探針的設計，利用探針與配體結合將配體的特性引入檢測過程中；逐漸提高檢測效率，該技術也逐漸由單重熒光定量檢測發(fā)展為多重Real-Time PCR以及液滴PCR的方法。

2.1.2.1 熒光探針法在單重Real-Time PCR中的應用

Taqman熒光探針法適用于檢測擴增序列專一的體系，以及樣品中靶基因含量較低的PCR檢測。ALI等[18]將豬線粒體Cyt b基因作為分析對象建立Taqman熒光探針，檢測混合肉中是否含有豬肉，該法檢出限低至0.01%，可用于測定商業(yè)漢堡中的豬肉摻假。MARTIN等[19]以豬線粒體12S rRNA基因為分析對象建立豬肉特異性引物，擴增來自豬肉DNA的411 bp片段，同時擴增來自哺乳動物物種DNA的425～428 bp片段用作內(nèi)源對照，未顯示其他動物DNA的交叉反應，該檢測方法對豬肉定量檢測的靈敏度在0.5%～5%。ZHANG等[20]則以牛線粒體Cyt b基因分析對象建立特異性引物和Taqman探針檢測熱處理純?nèi)庵信Ｔ葱猿煞值暮?，該法可最低定量檢測到35 pg的牛DNA，且未顯示與綿羊、山羊或豬DNA的交叉反應。但Taqman熒光探針也存在局限性，需要在保守區(qū)域內(nèi)擴增熒光探針的引物，并對保守序列的3個區(qū)域分別設計上下游引物，而找到合適的保守區(qū)域并不相容[21]。且無論怎么優(yōu)化引物設計條件都不能解決靶基因的特異序列較短的狀況，而且如果體系中存在與靶基因同源的序列，則容易出現(xiàn)非特異性擴增使得定量不準確。

分子信標優(yōu)于Taqman探針之處是能檢測單個核苷酸的突變，近年來，在肉類摻假檢測方面，YUSOP等[22]將豬的Cyt b基因作為分析對象設計引物及分子信標探針，建立Real-Time PCR體系用于檢測生肉混合樣品中豬肉的含量，其他樣品顯示陰性結果，這證實了引物的特異性，豬肉的檢出限為0.000 1 ng。MOHAMAD等[23]以豬的染色體DNA和Cyt b基因設計引物以及分子信標探針，用于定量檢測由明膠制品中含有的豬源性成分，結果表明基于染色體DNA和Cyt b基因的檢測方法可分別檢測體系中低至1 pg和10 pg的豬DNA。但分子信標存在設計困難、價格昂貴的局限性，且既要避免產(chǎn)生強的背景信號，又要避免其莖部與模板雜交過強，而致使退火過程受到影響[24]。可能正是引物分子信標具有的特性，致使其在檢測肉制品中有害微生物方面研究較多，相比之下在肉類摻假檢測方面的應用較少。

2.1.2.2 熒光探針在多重Real-Time PCR的應用

在Real-Time PCR技術的基礎上利用多對引物測定，可以在單次PCR反應中快速、準確地同時識別多個肉類品種[4]，基于Taqman探針的多重Real-Time PCR技術在肉類鑒定方面的應用較為廣泛。IWOBI等[25]以β-肌動蛋白基因和肌肉生長抑制素基因為分析對象建立引物和Taqman探針，建立三重Real-Time PCR技術用于特異性識別并量化混合肉中牛和豬成分，未顯示其他動物DNA的交叉反應，定量為0.5%～99.5%，該方法的檢測限為20個基因組當量。章晶晶等[26]以貉子線粒體D-loop基因和狐貍的線粒體基因為分析對象建立引物和探針，并根據(jù)各反應體系的Ct值驗證引物與探針對于狐貍和貉子源性成分的特異性，檢測肉制品中狐貍、貉子源性成分，最低檢測限分別為0.5 pg/μL和5 pg/μL。相比之下基于分子信標的多重Real-Time PCR技術應用于肉類摻假領域的研究較少，劉艷艷等[12]以線粒體基因組和16S rRNA基因設計引物和分子信標探針，建立多重Real-Time PCR體系能同時區(qū)分阿膠原料中的驢、馬、驢騾和馬騾源性成分，其他樣品顯示陰性結果，該法特異性強靈敏度高，檢測限達到0.01 ng/μL。

近年來，為使得基于熒光探針的檢測技術在肉類成分定量分析中的效率更高，出現(xiàn)了在Taqman探針的基礎上結合配體形成的新型探針，如Taqman-MGB和Taqman-LNA探針。這些與Taqman探針結合的配體往往具有某些特性，比如Minor Groove Binding (MGB)配體具有能選擇性結合富含AT堿基的序列特性[27]。近年來Taqman-MGB探針在多重Real-Time PCR的應用較多：ANDREO等[28]將t-Glu和Cyt b基因作為分析對象設計探針，在1%～20%特異性檢測混合肉中豬、牛以及雞肉的含量，原樣和熱處理樣的最低檢測限分別為1%和0.32 pg/μL。CHENG等[29]則利用β-肌動蛋白基因和生長因子基因設計引物以及Taqman-MGB探針，將鵝、馬、兔、牛、驢、鯽魚、綿羊和山羊源性物質(zhì)作為對照顯示為陰性，表明結果具有特異性，在1%～20%檢測雞、鴨和豬的成分在混合DNA中所含的量，檢測限達到0.15 ng。DRUML等[30]利用偽表皮生長因子基因建立Taqman-MGB探針，以鑒別混合肉DNA中小鹿、馬鹿以及梅花鹿的含量，該法未顯示肉類產(chǎn)品中可能含有的20種動物物種和43種植物物種的交叉反應，在0.1%～100%，檢測限達到0.1%。而新型探針Taqman-LNA在肉類摻假方面的應用也較為廣泛：XU等[31]將鴨、豬、牛和雞的線粒體DNA序列作為分析對象，設計特異性引物和TaqMan-LNA探針，開發(fā)并優(yōu)化了多重Real-Time PCR檢測體系，通過鑒定不相關的(綿羊、馬、鹿、驢、兔、鵝、山羊、蝦、鮭魚和玉米)線粒體DNA作為物種特異性靶標來驗證特異性，檢測限達到每個物種的0.01%。許如蘇等[32]利用線粒體基因組設計引物及探針，建立多重Taqman-LNA熒光PCR技術，同時檢測肉制品中豬雞鴨源性成分，與牛、羊、驢、兔、鵝等動物源性成分無交叉反應，其檢測限均達到肉含量的0.001%。許如蘇等[33]還基于馬的種屬保守序列設計特異性引物和Taqman-LNA探針，建立快速檢測肉制品中馬源性成分的檢測方法，與豬、牛、羊、鹿、驢、兔、雞、鴨、鵝和蝦源性成分無交叉反應，可檢測到馬肉DNA最低限為1.4 pg。

2.1.2.3 熒光探針液滴PCR

微滴數(shù)字PCR(dd PCR) 是先將待測樣品微滴化處理，再經(jīng)PCR擴增后逐個檢測每個液滴的熒光信號，根據(jù)泊松分布以及陽性微滴的個數(shù)與比例進行結果分析，實現(xiàn)對肉及肉制品的精確定量[17]。是傳統(tǒng)檢測技術的革新，在滿足目標物的絕對定量的同時具備更加快速、準確和靈敏的特點，在肉類摻假檢測方面應用較為廣泛。苗麗等[34-35]將羊、牛和豬的β-肌動蛋白基因作為分析對象設計引物和熒光探針，建立dd PCR法對肉制品中羊、牛和豬的含量進行定量分析，結果表明測量值和真實值基本一致，且不受外源物種的干擾，當核酸的含量在100～1 000 ng時，生鮮肉質(zhì)量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數(shù)之間均呈現(xiàn)明顯的線性關系。而CAI等[36]也利用豬和雞的β-肌動蛋白基因設計引物和熒光探針，建立了相似的dd PCR法精確定量檢測肉制品中的豬和雞源性成分，且不受外源物種的干擾。陳晨[17]根據(jù)牛羊豬雞鴨的基因組設計引物及探針，建立了dd PCR技術以實現(xiàn)牛肉和羊肉中摻入的豬鴨雞等動物源成分的定量分析，并構建牛羊豬雞鴨的生肉質(zhì)量和DNA濃度曲線以及DNA濃度和DNA拷貝數(shù)曲線，得到5個物種的拷貝數(shù)和生肉質(zhì)量的公式，實現(xiàn)了不同物種單一的定量檢測。EUN等[37]利用dd PCR技術高精度定量海產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚的含量：先將混合物分離成15 000～20 000個液滴，經(jīng)PCR擴增后通過液滴讀數(shù)器檢測TaqMan熒光，基于DNA拷貝數(shù)建立公式來計算原始樣品質(zhì)量，且檢測體系中原始樣品質(zhì)量，DNA濃度與DNA拷貝數(shù)之間同樣呈線性關系。

2.2 熒光染料法

2.2.1 熒光染料法的建立

如圖4所示，熒光染料能非特異嵌合于ds DNA雙螺旋小溝區(qū)域[38]。在激發(fā)光的作用下結合狀態(tài)的熒光強度遠遠高于游離態(tài)的熒光強度，隨著擴增的進行，熒光信號隨PCR產(chǎn)物的同步增加[39]。該法可以監(jiān)測任何ds DNA序列的擴增，設計引物容易且不需要探針，成本較低。

圖4 SYBR Green I實時熒光定量PCR反應過程示意圖[1]

Fig.4 The diagrammatic drawing of the process of SYBR Green I real-time PCR[1]

2.2.2 熒光染料法的應用

2.2.2.1 熒光染料法在單重Real-Time PCR中的應用

常見的熒光染料有：SYBR Green I和EvaGreen。SYBR Green I熒光染料是一種具有綠色激發(fā)波長的不對稱菁類熒光素，最大吸收波長和發(fā)射波長分別約為497 nm、520 nm。近年來，基于SYBR Green I的Real-Time PCR技術，在肉類摻假檢驗方面應用較為廣泛。SOARES等[40]以豬的Cyt b和18S rRNA基因為分析對象設計引物，并在體系中加入SYBR Green I熒光染料，該方法通過熔解曲線分析顯示出高度特異性，在0.1%～25%檢測混合肉中豬肉的含量，在原樣和熱處理樣中最低能檢測到5 pg和20 ng的豬DNA。郭云霞[41]等利用真核生物18S rRNA設計引物，對9種鯊魚及48種常見非鯊魚類動植物樣品進行檢測，非鯊魚樣品中均未出現(xiàn)擴增曲線，熔解曲線在(84±1.5)℃也未出現(xiàn)峰值，建立了基于SYBR Green I熒光染料的Real-Time PCR方法，用于特異性檢測食品中鯊魚源性成分，該法的檢測限為0.000 1 ng/μL。KANG等[42]則利用基于SYBR Green的Real-Time PCR技術，在100%～0.01%，對豬肉和牛肉混合物中豬肉的含量進行分析，并對建立的定量方法進行驗證和比較，以用于檢測牛肉加工制品中的豬肉摻假。

EvaGreen熒光染料是一種同時適用于Real-Time PCR反應和高分辨率熔解曲線分析的新一代熒光染料， EvaGreen與SYBR Green I熒光染料的光譜相似，且應用于現(xiàn)有定量PCR儀的兼容性良好，這種新型飽和染料能均勻地插入ds DNA，同時能在擴增過程中及時釋放DNA，減少對PCR過程的抑制，故基于EvaGreen熒光定量PCR反應的靈敏度相對較高，再加上該技術穩(wěn)定性良好，且具有相對較高的熒光強度和反應效率的特點[43]，近年來其應用也較為廣泛。LUBIS等[44]以豬的Cyt b基因設計引物，建立使用EvaGreen熒光染料的Real-Time PCR技術，以此檢測肉制品中豬的DNA含量，且通過9種非豬類動物和6種蔬菜種類(陰性)，證實了該法可測定豬DNA特異性。在生豬肉和雞肉的混合體系中檢測限低至0.001%。MEIRA等[45]同樣針對Cyt b基因設計新引物，建立定性定量檢測，來檢測加工食品中馬肉摻假的特性，該測定顯示出高靈敏度和特異性，在檢測牛和馬的混合體系中，最低可檢到0.1 pg的馬DNA。JOANA等[46]利用EvaGreen熒光定量PCR建立檢測體系，通過分析標準曲線以及熔解曲線達到對肉制品中豬肉含量定量檢測的目的，該方法利用盲肉混合物進行有效驗證，具有較強的精確性和可重復性，最低可檢到0.01 pg的豬DNA。

2.2.2.2 熒光染料在多重Real-Time PCR的應用

隨著Real-Time PCR技術的發(fā)展，往往需要建立多重熒光檢測技術，以達到同時檢測多個目標物種的目的，提高檢測效率。TAE等[14]利用瓦魚的COI和18S rRNA基因作為分析對象，建立Real-Time PCR反應體系，基于SYBR Green I熒光染料檢測混合肉中瓦魚種類，且未顯示20種其他物種DNA的交叉反應，證實了該法的特異性，其檢測限為0.1～0.001 ng/μL，同時開發(fā)了直接三重PCR和超快速Real-Time PCR技術用于現(xiàn)場食品分析。

ASING等[47]建立了基于SYBR Green熒光染料的雙重Real-Time PCR技術，以檢測肉丸和香腸等肉制品中馬來亞龜?shù)暮?，檢測過程中熔解曲線在74.63 ℃和78.40 ℃附近呈現(xiàn)了2個分別代表這種龜和真核生物的峰，該法的檢測限為0.001%。SAFDAR等[48]也建立了雙重實時PCR技術用于檢測飼料中的牛和家禽肉的含量，在79.5 ℃和87.5 ℃的溫度下，牛和家禽的基因產(chǎn)物分別產(chǎn)生2個不同的熔解峰，且體系也達到了0.001%的檢測限。WU等[9]以線粒體DNA和細胞基因組序列作為分析對象，建立基于SYBR Green熒光染料的多重Real-Time PCR體系，用于同時檢測混合體系中狐貍、狗、貂和兔的DNA含量，含量在5%～40%，相對偏差為1.98%～12.23%，相對標準偏差為3.06%～11.51%。而近年來基于EvaGreen熒光染料建立的多重Real-Time PCR技術，在肉類摻假檢測方面的應用也同樣較為廣泛： SAKALAR等[49]以豬和馬的12S rRNA和16S rRNA基因為研究對象設計引物，建立基于EvaGreen的多重Real-Time PCR技術，在0.1%～10%能同時檢測混合肉中馬和豬肉的含量，檢測限達0.000 01 ng/μL。SAKALAR等[50]還開發(fā)了基于EvaGreen的雙重Real-Time PCR檢測方法，該法特異性強，用于檢測肉類及肉制品中的牛肉和豬肉摻假，靈敏度達到0.001%。

3 展望

肉制品的巨大市場需求促使肉類摻雜使假現(xiàn)象趨于嚴重，為此建立完善肉類鑒別檢測方法成為熱點。以核酸為基礎的檢測技術種類豐富，包括：DNA探針雜交、普通PCR技術及其衍生技術。應用于快速定量檢測的Real-Time PCR技術以其特異性強、靈敏度高及操作簡單的特點，自問世以來倍受青睞，在食品檢測領域更是具有較高的應用價值。近年來，大量研究利用Real-Time PCR技術為基礎，建立了鑒別禽、畜和魚類的檢測方法，應用于肉類摻假檢測領域。

同時，Real-Time PCR技術仍存在一些挑戰(zhàn)：基于熒光染料的技術檢測簡便、價格便宜，但染料與DNA雙鏈的非特異性結合往往會影響結果的準確性，需要通過擴增曲線來判斷多個終產(chǎn)物的特異性[38]。相比之下，基于熒光探針的技術具有更強的特異性，但至關重要的目標基因選擇以及引物探針設計還較為困難，若體系中存在與靶基因同源的序列，則易出現(xiàn)非特異性擴增，使得定量不準確。單一的Real-Time PCR技術雖能解決定量檢測問題，但需要建立已知拷貝數(shù)的標準曲線才能得到目標序列的拷貝數(shù)，而檢測結果可能受到擴增效率的影響，所以該法并不能很好地達到絕對定量的要求[17]。

近年來，為使得檢測體系的定性定量結果更加準確，大量研究對此項技術進行了完善，使其應用空間更為廣闊。該技術的新興發(fā)展方向無疑是使檢測效率更高和檢測結果更可靠。在提升檢測效率方面：(1)縮短提取DNA的時間，目前，肉制品中DNA的提取是Real-Time PCR檢測技術的限速步驟；(2)縮短PCR反應時間，可利用高效設備如微量熒光定量PCR儀來實現(xiàn)；(3)增大單次檢測物種數(shù)目，結合多重PCR技術的思想，準確、高效地同時識別多個肉類品種；(4)讓檢測結果可視化，傳統(tǒng)Real-Time PCR技術是通過標準曲線計算目標物種的含量，此技術較為抽象，可結合等溫PCR技術的思想，通過產(chǎn)物或試紙條顏色變化呈現(xiàn)更直觀的結果。在提升檢測結果可靠性方面：(1)嚴格控制變量，由于不同組織肉樣的DNA豐度不同，基因拷貝數(shù)存在差異，選取不同的質(zhì)量梯度，準確建立生肉質(zhì)量和DNA拷貝數(shù)的關系曲線至關重要；(2)多角度分析結果，結合其他學科知識構建新型檢測體系，以當下新興的數(shù)字PCR技術為例，將檢測體系同統(tǒng)計概率學和“化一為萬”的技巧相結合，通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算檢測結果，不必對照標準樣品和標準曲線來實現(xiàn)絕對定量，不受擴增效率的影響[36]。

較為繁瑣的操作(公式的建立、摻假模型的設計)往往不利于檢測方法的推廣。通過標準化檢驗流程，整合DNA提取、擴增與檢測過程，將PCR技術與各項新技術(基因芯片、蛋白質(zhì)芯片等)有機結合[1,17]是未來的發(fā)展趨勢。隨著生物技術的飛速發(fā)展、新型熒光標記物的設計和新型檢測模式的深入研究，在肉類摻假檢測領域，建立以Real-Time PCR技術為基礎的新型簡單快速準確、高通量、低成本的檢測體系指日可待。