王夢(mèng)辰，劉鐵利，蔣玉涵，韓 亮，王微微，苗延巍

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射科，遼寧 大連 116011)

糖尿病腦病是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。T2DM是認(rèn)知功能下降的危險(xiǎn)因素之一[1]，患者可表現(xiàn)與阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)類似的認(rèn)知功能下降及癡呆癥狀[2]。AD患者腦組織典型病理改變?yōu)榈矸蹣应碌鞍?β-amyloid protein, Aβ)斑塊和tau蛋白過(guò)度磷酸化，伴有異常鐵沉積[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)T2DM腦病患者腦內(nèi)具有與AD患者類似的高水平Aβ。目前主要采用PET-CT行腦內(nèi)Aβ定量檢測(cè)[5]，價(jià)格昂貴，且存在輻射。SWI利用不同組織間磁敏感性的差異成像，可敏感顯示小靜脈、微出血、鐵沉積，且安全無(wú)輻射。T2DM認(rèn)知障礙患者中，海馬為最常受累部位[6]，而右側(cè)海馬在空間記憶方面占優(yōu)勢(shì)[7]。本研究觀察T2DM模型兔右側(cè)海馬區(qū)SWI相位值與海馬組織Aβ1-42表達(dá)的相關(guān)性，探討SWI檢測(cè)腦內(nèi)異常Aβ蓄積的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本雄性大耳白兔15只，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量2.66～3.44 kg，平均(3.02±0.27)kg，許可證編號(hào)：SCXK(遼)2013-0003。

1.2 動(dòng)物分組與建模 將15只兔隨機(jī)分為T(mén)2DM組(10只)和對(duì)照組(5只)。T2DM組參照文獻(xiàn)[8]方法制備T2DM模型，具體方法：高脂高糖(基礎(chǔ)飼料53%、豬油10%、蔗糖37%)喂養(yǎng)8周，行口服糖耐量試驗(yàn)及胰島素釋放試驗(yàn)，對(duì)出現(xiàn)胰島素抵抗者至少停飼12 h；以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質(zhì)量)麻醉后，經(jīng)耳緣靜脈注射新配制的2%鏈脲佐菌素溶液(65 mg/kg體質(zhì)量)，72 h后再次注射同等劑量新配制的鏈脲佐菌素溶液。之后每2周檢測(cè)1次空腹血糖，連續(xù)2次空腹血糖高于11.0 mmol/L視為造模成功，最終造模成功7只。對(duì)照組全程給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 儀器與方法 于造模成功后第2、6、10周末行MR掃描。采用GE Signa HDxt 3.0T MR掃描儀，8通道膝關(guān)節(jié)線圈。掃描前給予兔3%戊巴比妥鈉溶液(1 ml/kg體質(zhì)量)麻醉，掃描時(shí)俯臥位保定動(dòng)物，使頭部稍抬高，暴露頸部，進(jìn)行軸位T2 FLAIR及軸位SWI掃描，掃描層面垂直于顱底，覆蓋全腦，總掃描時(shí)間約10 min。參數(shù)：軸位T2 FLAIR序列，TR 9 000 ms，TE 168 ms，TI 2 250 ms，層厚3 mm，層間距0.5 mm，矩陣256×160，F(xiàn)OV 120 mm×120 mm，NEX 1，F(xiàn)A 90°；軸位SWI序列，TR 79.1 ms，層厚2 mm，層間距0 mm，矩陣320×288，F(xiàn)OV 120 mm×120 mm，NEX 0.69，F(xiàn)A 20°。

1.3 圖像后處理與分析 將3次掃描的SWI原始數(shù)據(jù)傳至GE Advantage Workstation 4.6后處理工作站，選擇Functool軟件進(jìn)行去噪及濾波，獲得SWI幅度圖(magnitude imaging, MI)和相位圖(phase imaging, PI)，見(jiàn)圖1。對(duì)照兔腦解剖圖譜[9]，在SWI原始圖像右側(cè)海馬部位手動(dòng)勾畫(huà)ROI(盡量避開(kāi)腦脊液、血管、顱骨)，面積約4 mm2，獲得右側(cè)海馬區(qū)相位值， 以3次測(cè)量的平均值作為結(jié)果。

1.4 Aβ1-42表達(dá)檢測(cè) 完成MR檢查后，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg體質(zhì)量)深度麻醉動(dòng)物，開(kāi)胸后將導(dǎo)管插入左心室，經(jīng)導(dǎo)管灌注常溫生理鹽水，待右心房流出液變清，灌入4%多聚甲醛約1 000 ml。斷頭后取腦，參照兔腦解剖圖譜[9]取右側(cè)海馬，將海馬組織常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片，行Aβ1-42免疫組織化學(xué)染色。采用高倍顯微鏡(×400)觀察海馬組織Aβ1-42表達(dá)，以Image-Pro Plus圖像分析軟件計(jì)算平均光密度。平均光密度=積分光密度/觀察區(qū)域面積。每只兔選取3張右側(cè)海馬切片染色，取平均值作為結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較同一掃描時(shí)間點(diǎn)2組間右側(cè)海馬相位值及海馬組織Aβ1-42表達(dá)的差異。采用重復(fù)測(cè)量方差分析比較同組3次右側(cè)海馬相位值的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以Pearson相關(guān)分析觀察T2DM兔右側(cè)海馬區(qū)相位值與海馬組織Aβ1-42表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

T2DM組兔第2、6、10周末右側(cè)海馬區(qū)相位值逐漸減低(F=12.30，P<0.01)；對(duì)照組兔亦逐漸減低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.05，P=0.85)。T2DM組第2、6、10周末右側(cè)海馬區(qū)相位值均低于對(duì)照組，但僅第10周末組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.07，P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 T2DM組與對(duì)照組兔右側(cè)海馬相位值比較(×10-3，±s)

表1 T2DM組與對(duì)照組兔右側(cè)海馬相位值比較(×10-3，±s)

組別第2周末第6周末第10周末F值P值T2DM組(n=7)-(38.03±9.87)-(43.23±7.85)-(61.73±10.23)12.30<0.01對(duì)照組(n=5)-(29.22±7.22)-(33.50±8.25)-(41.00±7.42)3.050.85t值-1.79-2.06-4.07——P值0.110.07<0.01——

圖1 T2DM組和對(duì)照組兔腦SWI圖像及PI A、B.對(duì)照組兔造模第10周末SWI原始圖像(俯臥位，A)及PI(俯臥位，B)； C、D.T2DM組兔造模第10周末SWI原始圖像(俯臥位，C)及PI(俯臥位，D)

圖2 T2DM組和對(duì)照組兔右側(cè)海馬組織Aβ1-42免疫組織化學(xué)染色(×400) A. 對(duì)照組； B.T2DM組

T2DM組、對(duì)照組兔右側(cè)海馬組織Aβ1-42平均光密度值分別為0.20±0.04、0.09±0.01，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-7.07，P<0.01)，見(jiàn)圖2。

T2DM兔右側(cè)海馬區(qū)相位值與海馬組織Aβ1-42表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.88，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

3 討論

糖尿病腦病發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與腦胰島素抵抗密切相關(guān)。正常狀態(tài)下，胰島素具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用[10]。胰島素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)的主要功能是降解胰島素及Aβ，是調(diào)控胰島素和Aβ含量的關(guān)鍵物質(zhì)。機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗時(shí)，腦內(nèi)胰島素含量增高，胰島素競(jìng)爭(zhēng)性抑制IDE介導(dǎo)的Aβ降解，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ清除障礙而蓄積[11]。除促進(jìn)Aβ蓄積外，胰島素抵抗還可通過(guò)改變胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、β分泌酶活性促進(jìn)Aβ生成與蓄積[12]。糖尿病腦病的病理改變與AD腦改變極其相似[4]。Aβ是一種多肽類物質(zhì)，最常見(jiàn)亞型是Aβ1-40和Aβ1-42，Aβ1-42的毒性更強(qiáng)，且更易蓄積，從而形成Aβ沉淀核心，引發(fā)神經(jīng)毒性[13]。本研究結(jié)果顯示，T2DM組兔右側(cè)海馬區(qū)存在Aβ異常蓄積，與既往研究[4-5]結(jié)果相符。

鐵是影響腦組織相位值的主要物質(zhì)，SWI相位信號(hào)與鐵含量呈負(fù)相關(guān)。Aβ蓄積時(shí)存在鐵結(jié)合位點(diǎn)[14]，Aβ斑塊形態(tài)與鐵直接相關(guān)，且可形成鐵-淀粉樣復(fù)合物[15]。鐵通過(guò)影響淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)APP，促進(jìn)Aβ生成[16]。上述研究結(jié)果提示腦鐵含量與Aβ生成與蓄積相關(guān)，因此，理論上SWI可間接檢測(cè)腦內(nèi)異常Aβ蓄積。Meadowcroft等[17]采用小鼠模型研究SWI相位值與腦鐵之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn) Aβ可通過(guò)縮短橫向弛豫時(shí)間進(jìn)而影響SWI相位值。本研究對(duì)T2DM組及對(duì)照組兔分別在造模后2、6、10周末行3次SWI掃描，結(jié)果顯示2組兔右側(cè)海馬區(qū)相位值隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而減低，且T2DM組均低于對(duì)照組。由此推測(cè)，隨兔齡增加及T2DM患病時(shí)間延長(zhǎng)，2組兔腦內(nèi)鐵含量均增多，而糖尿病加劇了兔齡增加所致的腦內(nèi)鐵含量增多。

圖3 T2DM兔右側(cè)海馬區(qū)SWI相位值與海馬組織Aβ1-42表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖

本研究中T2DM組兔右側(cè)海馬區(qū)相位值與海馬組織Aβ1-42表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示相位值可間接反映Aβ異常蓄積，這對(duì)進(jìn)一步探討T2DM腦損傷SWI表現(xiàn)的機(jī)制具有重要意義。文獻(xiàn)[18]報(bào)道，通過(guò)SWI檢測(cè)淀粉樣斑塊內(nèi)及周圍鐵沉積，可間接反映斑塊數(shù)量。關(guān)于AD小鼠的研究[19]結(jié)果也顯示SWI平均相位值與鐵蛋白數(shù)量、斑塊范圍具有相關(guān)性，提示相位值可反映Aβ蓄積。Yang等[20-21]報(bào)道，SWI檢測(cè)結(jié)果顯示T2DM患者腦組織磁敏感值與其認(rèn)知評(píng)分相關(guān)，而認(rèn)知評(píng)分與Aβ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示T2DM兔右側(cè)海馬相位值與Aβ1-42蓄積并非完全相關(guān)(完全相關(guān)指r=1或-1)，提示除Aβ周圍鐵沉積之外，可能尚有其他因素導(dǎo)致相位值變化，如微出血[22]。

綜上所述，SWI可間接反映T2DM兔海馬組織Aβ蓄積。但本研究樣本量較少，觀察腦區(qū)僅局限于右側(cè)海馬，且未行鐵蛋白染色，有待進(jìn)一步完善。