馬瑞肖，張慧杰，李馨慧，張淑蘭

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

宮頸癌具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，且近年來(lái)發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)［1-2］。雖然腫瘤的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，但是大部分腫瘤都可以通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)代謝方式來(lái)滿(mǎn)足其物質(zhì)和能量的需求。除腫瘤細(xì)胞內(nèi)有氧糖代謝引起關(guān)注外［3］，谷氨酰胺 （glutamine，Gln） 提供碳源推動(dòng)三羧酸循環(huán)提供能量，提供氮源合成其他氨基酸、核苷酸等大分子物質(zhì)，以及合成還原性物質(zhì)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，支持了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［4-6］。因此，本研究主要探討Gln缺乏對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試劑和儀器： DMEM， high glucose， pyruvate，no glutamine培養(yǎng)基 （Thermo Fisher Scientific，10313039）；L-glutamine （200 mmol/L） （Thermo Fisher scientific）；雙抗 （美國(guó)Hyclon公司）；CCK-8 試劑盒；胎牛血清 （Aus Genenx，貨號(hào)：FBS500-S）；細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國(guó)Termo公司） 。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將Hela細(xì)胞凍存管從-80 ℃冰箱中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中快速搖晃，待融化后將細(xì)胞懸液移至15 mL離心管中，加入正常完全培養(yǎng)基，即10%FBS+4 mmol/L Gln+1%雙抗 （青霉素+鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基4 mL，混勻，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心5 min，棄掉上清液，加入完全培養(yǎng)基吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液后移至T25培養(yǎng)瓶中放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此為細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程；細(xì)胞換液：棄去舊培養(yǎng)基，PBS沖洗，再加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；細(xì)胞傳代：用0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞后加入新鮮的完全培養(yǎng)基，按1∶2～1∶4傳代培養(yǎng)；細(xì)胞凍存：用細(xì)胞凍存液 （完全培養(yǎng)基∶DMSO=9∶1）凍存細(xì)胞。因正常培養(yǎng)基中Gln濃度為4 mmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以含4 mmol/L Gln培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.2.2 CCK-8方法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況：胰酶常規(guī)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，配制單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)副孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度Gln完全培養(yǎng)基 （其中0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L Gln為實(shí)驗(yàn)組、4 mmol/L Gln 為對(duì)照組） 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后更換新培養(yǎng)基100 μL/孔+10 μL CCK-8溶液/孔，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm的吸光度；然后于原相應(yīng)Gln濃度的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用上述同樣的方法測(cè)定每孔的吸光度 （optical delnsity，OD）。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率=1-增殖率，增殖率= （實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值） / （對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值） ］。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察不同Gln濃度條件下Hela細(xì)胞遷移能力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后，2 mL/孔平均鋪于6孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；次日顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)約90%，用直尺和10 μL槍頭垂直劃痕；用PBS沖洗3遍，分別加入含不同濃度Gln+3%FBS的培養(yǎng)基 （其中0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L Gln為 實(shí) 驗(yàn) 組、4 mmol/L Gln為對(duì)照組） 于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；于0點(diǎn)和12點(diǎn)在顯微鏡下拍照。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 PE Annexin V Apoptosis Detection Kit 方法檢測(cè)各組Hela細(xì)胞凋亡的情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后，500 μL/孔平均鋪于24孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度Gln完全培養(yǎng)基 （其中0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L Gln為實(shí)驗(yàn)組、4 mmol/L Gln為對(duì)照組） 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 DCFH-DA活性氧熒光探針檢測(cè)各組Hela細(xì)胞內(nèi)活性氧 （reactive oxygen species，ROS） 水平：常規(guī)消化收集細(xì)胞，2 mL/孔平鋪于6孔板后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度Gln完全培養(yǎng)基 （其中Gln為0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L為實(shí)驗(yàn)組、4 mmol/L Gln為對(duì)照組） 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 7軟件作圖分析。采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示；多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢測(cè)法，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gln缺乏抑制Hela細(xì)胞增殖

相對(duì)于在含4 mmol/L Gln培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的Hela細(xì)胞，當(dāng)Gln＜2 mmol/L時(shí)，Hela細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制 （P ＜ 0.05），且隨著Gln濃度降低，Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率升高；在Gln≤1 mmol/L時(shí)，相同Gln濃度條件下培養(yǎng)96 h的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率普遍比培養(yǎng)48 h高（表1）。說(shuō)明Hela細(xì)胞生長(zhǎng)與Gln呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。

2.2 Gln缺乏抑制Hela細(xì)胞遷移

相對(duì)于在含4 mmol/L Gln培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，當(dāng)Gln＜2 mmol/L時(shí)Hela細(xì)胞的劃痕愈合率顯著下降，且隨著Gln濃度的降低，劃痕愈合率越低，細(xì)胞的遷移能力也越小 （表2，圖1）。說(shuō)明了Gln維持著Hela細(xì)胞的遷移能力。

表1 不同濃度Gln處理的Hela細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 （n = 5，）Tab.1 Cell growth inhibition rate at different time points of cells treated with different concentrations of Gln （n = 5，）

表1 不同濃度Gln處理的Hela細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 （n = 5，）Tab.1 Cell growth inhibition rate at different time points of cells treated with different concentrations of Gln （n = 5，）

Compared with 4 mmol/L Gln group，1） P ＜ 0.01，2） P ＜ 0.05.

Group 48 h 96 h 4 mmol/L Gln 0.002±0.004 0.000±0.000 2 mmol/L Gln 0.064±0.105 0.058±0.0262）1 mmol/L Gln 0.166±0.0781） 0.262±0.2292）0.5 mmol/L Gln 0.278±0.1061） 0.380±0.1211）0.1 mmol/L Gln 0.442±0.1141） 0.656±0.1331）0 mmol/L Gln 0.628±0.1611） 0.714±0.1331）

2.3 Gln缺乏誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡

相對(duì)于在含4 mmol/L Gln培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，當(dāng)Gln＜0.5 mmol/L時(shí)Hela細(xì)胞的死亡數(shù)顯著增多 （P ＜ 0.05），Gln≥1 mmol/L時(shí)不能誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡 （表2，圖2）。說(shuō)明Gln濃度降低到一定程度時(shí)可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。

2.4 Gln缺乏誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高

相對(duì)于在含4 mmol/L Gln培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，當(dāng)Gln＜1 mmol/L時(shí)Hela細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng) （P ＜ 0.05） ，且隨著Gln濃度降低，Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，Gln≥1 mmol/L時(shí)不能影響細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化，見(jiàn)表2。表明了Gln缺乏可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。

表2 不同濃度Gln處理組Hela細(xì)胞遷移能力、凋亡百分比和細(xì)胞內(nèi)ROS水平情況 （n = 3，）Tab.2 Migration ability，apoptosis percentage，and intracellular ROS level of Hela cells treated with different concentration of Gln （n =3，）

表2 不同濃度Gln處理組Hela細(xì)胞遷移能力、凋亡百分比和細(xì)胞內(nèi)ROS水平情況 （n = 3，）Tab.2 Migration ability，apoptosis percentage，and intracellular ROS level of Hela cells treated with different concentration of Gln （n =3，）

Compared with 4 mmol/L Gln group，1） P ＜ 0.01，2） P ＜ 0.05.

Group Wound healing rate Percentage of apoptosis （%） Mean fluorescence intensity 0 mmol/L Gln 0.209±0.0481） 10.717±1.9691） 309.300±104.6002）0.1 mmol/L Gln 0.277±0.0321） 9.930±1.4131） 216.700±65.9002）0.5 mmol/L Gln 0.326±0.0201） 6.237±1.910 209.000±43.5002）1 mmol/L Gln 0.403±0.0362） 3.883±0.670 179.700±42.500 2 mmol/L Gln 0.459±0.017 3.143±0.263 156.700±99.900 4 mmol/L Gln 0.503±0.020 3.023±1.155 92.600±33.900

圖1 在不同濃度Gln中Hela細(xì)胞在0 h和12 h的遷移位置

圖2 Gln缺乏對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

宮頸癌嚴(yán)重危害著女性健康，從1956年“Warburg效應(yīng)”發(fā)現(xiàn)到2011年報(bào)道腫瘤細(xì)胞代謝改變?yōu)槟[瘤特征之一，腫瘤代謝重編程成為了腫瘤研究的新熱點(diǎn)［1-3，6］，這為尋找新的更有效的宮頸癌治療方法提供了方向。

因存在“Warburg效應(yīng)”，葡萄糖來(lái)源的丙酮酸僅少部分進(jìn)入TCA循環(huán)，絕大多數(shù)通過(guò)乳酸脫氫酶以乳酸形式排出。在這種情況下，Gln可以很好地回補(bǔ)TCA循環(huán)為腫瘤細(xì)胞提供能量，合成NADPH和GSH，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)等［4，6］。眾所周知，急性高濃度ROS導(dǎo)致細(xì)胞衰老甚至死亡［7］，因此Gln代謝對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)非常重要。

WANG等［8］研究表明，Gln蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體ASCT2在前列腺癌組織中高表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞中ASCT2的功能導(dǎo)致Gln攝取減少可能是抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的主要原因。LAMPA等［9］研究表明，抑制谷氨酰胺酶使Gln代謝途徑流量減少，從而抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)Gln缺乏顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性，與上述研究結(jié)果相符合。賴(lài)彥等［10］研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌A549細(xì)胞在4 mmol/L Gln的培養(yǎng)基中抑制率為0，在0 mmol/L和2 mmol/L Gln培養(yǎng)基中Gln濃度越低，作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率越高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果一致。過(guò)表達(dá)miR-513c可抑制神經(jīng)母細(xì)胞中谷氨酰胺酶的表達(dá)從而抑制了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［11］?？档拢?2］研究表明谷氨酰胺酶GAC變構(gòu)抑制劑-968抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移。本研究發(fā)現(xiàn)隨著Gln濃度越低，Hela細(xì)胞遷移能力越低。Gln＜0.5 mmol/L時(shí)細(xì)胞遷移能力明顯下降且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與上述研究結(jié)果相符合。Gln缺乏誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能與ATP、嘧啶環(huán)合成減少、細(xì)胞周期阻滯等有關(guān)，也有研究［13-18］報(bào)道Gln饑餓或敲低谷氨酰胺酶引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高導(dǎo)致細(xì)胞死亡。李哲等［13］研究發(fā)現(xiàn)EGCG可通過(guò)降低谷氨酰胺脫氫酶活力來(lái)抑制結(jié)直腸癌DLD-1細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。KOYUNCU 等［16］研究結(jié)果表明芳香磺胺S-1通過(guò)上調(diào)ROS的產(chǎn)生來(lái)誘導(dǎo)CAIX表達(dá)陽(yáng)性的宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)Gln＜0.5 mmol/L時(shí)Hela細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多，Gln≤0.5 mmol/L時(shí)Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平也顯著升高，與上述研究相符合，提示Gln缺乏可通過(guò)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高導(dǎo)致其凋亡。但是當(dāng)Gln≥8 mmol/L時(shí)，Gln濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制率越高，提示Gln抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，在含32 mmol/L Gln培養(yǎng)基中A549細(xì)胞遷移數(shù)明顯少于在含4 mmol/L Gln培養(yǎng)基中［10］。結(jié)果的差異在于所取Gln濃度不一樣。目前很多研究［19-22］表明，給予惡性腫瘤患者Gln支持治療有助于提高免疫功能、減緩惡液質(zhì)形成等，并且還沒(méi)有證據(jù)證明其有促進(jìn)腫瘤的作用，因此Gln營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩時(shí)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制的進(jìn)一步研究，能為宮頸癌治療提供理論依據(jù)，對(duì)提高宮頸癌的治療效果和改善宮頸癌患者生活質(zhì)量有重要意義。

總之，本研究結(jié)果顯示，Gln缺乏能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān)。