孫駿，張磊，趙威，馬洪冬，王新棟，李海天，楊茂偉

（1. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽(yáng) 110001； 2. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院手足外科，遼寧 錦州 121000）

近年來(lái)糖尿病發(fā)病率日益升高，對(duì)人類的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。糖尿病可以導(dǎo)致多種并發(fā)癥，如心血管疾病、神經(jīng)疾病等，特別是糖尿病導(dǎo)致的糖尿病性骨質(zhì)疏松，極易出現(xiàn)致殘甚至致死的嚴(yán)重后果，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)［1］。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞作為人體內(nèi)骨代謝系統(tǒng)的重要組成部分，在骨穩(wěn)態(tài)的維持中起到關(guān)鍵作用。已有大量的研究［2-3］證實(shí)高糖對(duì)于成骨細(xì)胞具有抑制作用，然而關(guān)于高糖對(duì)破骨細(xì)胞的作用目前仍然存在爭(zhēng)議。有研究［5］表明，高糖降低破骨細(xì)胞的分化和功能，但還有研究［6］觀察到相反的結(jié)果。2種細(xì)胞在體內(nèi)并不是單獨(dú)存在的，已有研究［7］證實(shí)二者間存在多種交流途徑，可以相互調(diào)控。還有研究［8］證實(shí)，成骨細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成。其中單核細(xì)胞趨化蛋白-1 （monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1） 對(duì)破骨細(xì)胞的分化、形成至關(guān)重要，MCP-1可以加速破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的募集，并促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟，從而發(fā)揮骨吸收功能［9］。破骨細(xì)胞的分化成熟是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，c-fos/NFATC1通路在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，c-fos、NFATC1任一缺失將導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體細(xì)胞無(wú)法分化為成熟的破骨細(xì)胞［10］。本研究旨在證實(shí)高糖環(huán)境下共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，并探究MCP-1/c-fos/NFATC1信號(hào)通路在破骨細(xì)胞分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)試劑

小鼠成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1及小鼠單核細(xì)胞株Raw264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，分別用含10%胎牛血清的α-MEM、DMEM HG培養(yǎng)基 （美國(guó) Hyclone公司）培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入1%青鏈霉素 （美國(guó)Invitrogen公司），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。核因子-κB受體活化因子配體 （receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、小鼠MCP-1 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司；Bindarit （MCP-1抑制劑） 購(gòu)自美國(guó)MCE公司；抗MCP-1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；抗c-fos抗體、抗NFATC1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 共培養(yǎng)體系的構(gòu)建以及高糖環(huán)境的加載：應(yīng)用膜孔徑為0.4 μm的6孔Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)（美國(guó)Corning公司） 構(gòu)建共培養(yǎng)體系。簡(jiǎn)而言之，MC3T3-E1細(xì)胞密度15 000/cm2，接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)下層。Raw264.7細(xì)胞密度3 000/cm2，接種于上層小室。此系統(tǒng)應(yīng)用α-MEM培養(yǎng)基 （培養(yǎng)基基礎(chǔ)糖濃度5.5 mmol/L），補(bǔ)充以10%胎牛血清，1%青鏈霉素，并加入50 ng/mL RANKL和30 ng/mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子。為了探究高糖環(huán)境對(duì)共培養(yǎng)體系的影響，分別設(shè)置正常組 （糖濃度5.5 mmol/L）、高糖組（糖濃度20.5 mmol/L） 以及高糖 （糖濃度20.5 mmol/L） +Bindarit （10 ng/mL） 組，共培養(yǎng)4 d后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 成骨細(xì)胞MCP-1分泌測(cè)定：培養(yǎng)后，提取各組培養(yǎng)基上清液，離心去除殘留細(xì)胞。應(yīng)用小鼠MCP-1試劑盒檢測(cè)上清液中MCP-1含量。具體步驟按照制造商方案進(jìn)行。

1.2.3 TRAP染色測(cè)定：培養(yǎng)后，破骨細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，并根據(jù)試劑盒 （美國(guó)Sigma-Aldrich公司） 說(shuō)明進(jìn)行染色。含有3個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞核的暗紅細(xì)胞計(jì)為TRAP+多核細(xì)胞。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)：處理后，4 ℃下在細(xì)胞中加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制的裂解緩沖液裂解30 min，隨后在4 ℃下以12 000 g離心30 min后收集含有總蛋白質(zhì)的上清液。總蛋白提取后，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品 （50 μg蛋白質(zhì)），并在60 V下轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上2 h。用含有5%脫脂乳的封閉緩沖液封閉膜2 h。然后在4 ℃以1∶100至1∶1 000稀釋的一抗孵育過(guò)夜。隨后，將膜與二抗 （抗小鼠或抗兔） 一起溫育。IgG以1∶6 000或1∶10 000稀釋并與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，在室溫下孵育2 h。用EC3成像系統(tǒng) （美國(guó)UVP公司） 顯現(xiàn)條帶，使用ImageJ軟件測(cè)量每個(gè)條帶的光密度與內(nèi)參蛋白β-actin的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境促進(jìn)成骨細(xì)胞MCP-1的表達(dá)與分泌

為了探究高糖環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細(xì)胞MCP-1表達(dá)與分泌的影響，檢測(cè)成骨細(xì)胞MCP-1的表達(dá)。結(jié)果 （圖1A） 顯示，與正常組相比，高糖組中成骨細(xì)胞的MCP-1表達(dá)明顯升高。隨后檢測(cè)了MCP-1在本系統(tǒng)培養(yǎng)基上清中的含量。結(jié)果 （圖1B） 顯示，與正常組相比，高糖組培養(yǎng)基上清MCP-1的含量同樣明顯增加。這些結(jié)果表明，高糖環(huán)境促進(jìn)了成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中成骨細(xì)胞MCP-1的表達(dá)與分泌。

2.2 MCP-1激活c-fos/NFATC1信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化形成

為了探討MCP-1/c-fos/NFATC1信號(hào)通路對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，首先檢測(cè)破骨細(xì)胞分化形成指標(biāo)TRAP染色。結(jié)果 （圖2A） 顯示，與正常組相比，高糖組中TRAP+細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而高糖+Bindarit組TRAP+細(xì)胞數(shù)量顯著減少。接下分別檢測(cè)各組破骨細(xì)胞c-fos、NFATC1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 （圖2B） 顯示，與正常組相比，高糖組中的破骨細(xì)胞c-fos、NFATC1的表達(dá)明顯升高，而高糖+Bindarit組中破骨細(xì)胞c-fos、NFATC1的表達(dá)明顯降低。這些結(jié)果表明，高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞可以通過(guò)MCP-1/c-fos/NFATC1信號(hào)通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化形成。

圖1 高糖促進(jìn)成骨細(xì)胞MCP-1的表達(dá)與分泌Fig.1 High glucose increases the expression and secretion of MCP-1 in osteoblasts

3 討論

糖尿病性骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響人類的健康，病理性的葡萄糖水平可以打破骨形成與骨吸收之間的平衡，造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本課題組前期研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，糖尿病動(dòng)物模型中存在嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，并且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖對(duì)成骨細(xì)胞表現(xiàn)為抑制作用。

目前的研究多數(shù)局限于高糖對(duì)于單獨(dú)的成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的作用，然而在體內(nèi)，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞并非單獨(dú)存在，關(guān)于高糖情況下二者之間是否存在相互作用仍然知之甚少。此外，現(xiàn)有研究對(duì)于高糖對(duì)破骨細(xì)胞的作用仍存在大量爭(zhēng)議。已有研究［8］證實(shí)，作為高度發(fā)達(dá)的終末細(xì)胞，旁分泌途徑是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間交流的重要途徑之一。因此，應(yīng)用成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系作為模型能夠更好的反映生物體內(nèi)的環(huán)境，更有利于探究其中的復(fù)雜機(jī)制。

圖2 MCP-1/c-fos/NFATC1信號(hào)通路參與調(diào)控破骨細(xì)胞的分化Fig.2 MCP-1/c-fos/NFATC1 pathway is involved in osteoclastogenesis

Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)是目前比較成熟且應(yīng)用廣泛的一個(gè)系統(tǒng)，是探究2種細(xì)胞間相互作用的極佳方式。在本系統(tǒng)中，2種細(xì)胞在共同的環(huán)境中生長(zhǎng)而不相互接觸，而細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在上清液中可以自由交換。本研究采用了透光度良好的、孔徑為0.4 μm的PET膜6孔Transwell系統(tǒng)，既往研究［17］證實(shí)了該系統(tǒng)中成骨細(xì)胞具備相應(yīng)的活性，并能使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為成熟的破骨細(xì)胞并具備骨吸收功能。

MCP-1是一種趨化因子，能大量募集單核細(xì)胞并促進(jìn)單核細(xì)胞的融合。有研究［11］顯示，關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動(dòng)的患者呈現(xiàn)MCP-1陽(yáng)性，因此MCP-1可能與破骨細(xì)胞的形成密切相關(guān)。為了進(jìn)一步明確高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，本研究首先分析了高糖環(huán)境下共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞分泌MCP-1的變化。結(jié)果顯示，高糖顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的MCP-1分泌。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下單獨(dú)培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)，上清中MCP-1含量很低，甚至無(wú)法測(cè)出。這似乎是由于共培養(yǎng)系統(tǒng)中破骨細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞的分泌同樣有重要的調(diào)控作用 （數(shù)據(jù)未顯示）。這也表明了共培養(yǎng)系統(tǒng)能夠較好的反映體內(nèi)真實(shí)環(huán)境。Bindarit能夠抑制MCP-1，可以有效的降低培養(yǎng)基中MCP-1的含量［12］。而在本系統(tǒng)內(nèi)加入Bindarit后，破骨細(xì)胞的分化水平顯著下降。這些結(jié)果提示，成骨細(xì)胞可以通過(guò)MCP-1的分泌來(lái)調(diào)控破骨細(xì)胞的分化形成。

c-fos/NFATC1信號(hào)通路的激活對(duì)破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要。研究顯示，破骨細(xì)胞形成是由MAPK（p38、JNK和ERK） 和NF-κB途徑嚴(yán)格調(diào)節(jié)的多步驟過(guò)程，在此過(guò)程中誘導(dǎo)c-fos和NFATC1的表達(dá)，在破骨細(xì)胞分化的過(guò)程中這些途徑的消除會(huì)嚴(yán)重降低破骨細(xì)胞的形成和骨吸收功能。還有研究［13-15］表明，c-fos敲除小鼠出現(xiàn)完全缺乏破骨細(xì)胞的表型。鑒于此信號(hào)通路對(duì)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵作用，本研究探究了MCP-1對(duì)此信號(hào)通路的影響，結(jié)果證明了MCP-1能顯著促進(jìn)共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的分化，而應(yīng)用Bindarit后c-fos、NFATC1的表達(dá)也隨之降低，TRAP+細(xì)胞數(shù)量下調(diào)。

總而言之，本研究結(jié)果表明，高糖促進(jìn)成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞的MCP-1分泌，進(jìn)而激活MCP-1/c-fos/NFATC1信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。這些結(jié)論為治療糖尿病性骨質(zhì)疏松提供了一些思路。然而，這個(gè)共培養(yǎng)模型仍存在一定的不足，其并不能完美還原生物體內(nèi)骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞的接觸環(huán)境。目前新出現(xiàn)了一種3D培養(yǎng)模型［16］，通過(guò)植入羥基磷灰石模擬骨基質(zhì)，能更精確的反映骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞三者在生物體內(nèi)的真實(shí)接觸情況，這將成為后續(xù)研究的方向。