田 丹，田 苗，張蕾蕾，李金龍

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院麻醉科，長春 130041；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦 產(chǎn)科，長春 130041；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院胃腸營養(yǎng)及疝外科，長春 130041）

小腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）損傷指的是由于出血、創(chuàng)傷、感染性休克、嚴(yán)重?zé)齻?，及某些外科處理過程（如小腸移植、腹主動脈手術(shù)或心臟旁路手術(shù)等）等情況導(dǎo)致的一種情況[1]。眾所周知，小腸I/R不僅可導(dǎo)致小腸本身的損傷，亦可因?yàn)樾∧c粘膜屏障的損傷造成多器官功能失調(diào)。I/R后小腸黏膜功能的損害機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，活性氧（ROS）誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化是目前所知致使小腸黏膜損傷的主要因素之一，而去除氧自由基也成為減輕小腸I/R后損傷的重要手段。顯而易見，早期預(yù)防并干預(yù)小腸缺血再灌注損傷有著重要的臨床意義。最近亦有研究表明，在動物模型中，使用鎮(zhèn)靜劑量的異丙酚治療，尤其是預(yù)處理，可以減輕腸I/R誘導(dǎo)的腸粘膜損傷[2-4]。在本研究中，我們將探討丙泊酚對腸I/R后腸損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 試劑 丙泊酚注射液（英國阿斯利康公司）， 鄰聯(lián)二回香胺（美國Sigma 公司）， 1, 5-戊二胺（美國Sigma公司）， 二胺氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品（diamineoxidase, DAO，美國Sigma 公司）， 辣根過氧化物酶（上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）、考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），原位凋亡細(xì)胞TUNEL（末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的切口末端標(biāo)記法）檢測試劑盒、蛋白酶K 、DNA 酶Ⅰ（DnaseⅠ）（德國Roche 公司），其余試劑或?yàn)檫M(jìn)口分裝生物學(xué)級或?yàn)閲a(chǎn)分析純試劑。

1.2 動物模型的建立 4～6月齡新西蘭兔40只[吉林大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證編號：SCXK-（吉）2010-0006]， 雌雄各半， 體質(zhì)量2.5～3.5 kg，手術(shù)前禁食12 h ， 自由飲水。術(shù)前用3%苯巴比妥（30 mg/kg）耳緣靜脈注射麻醉，取緣靜脈開放輸液通道輸注乳酸林格液。取腹部正中切口，顯露腸系膜上靜脈（SMA）。除對照組，其他3組動物均在分離SMA15 min后夾閉SMA 60 min，然后開放SMA，并于開放后120 min處死。對照組僅顯露SMA，不進(jìn)行夾閉，其他處理相同。

1.3 動物分組 隨機(jī)分為4 組，每組10只。腸缺血再灌注組（I/R組）：腸缺血60 min，再灌注120 min；丙泊酚預(yù)處理組（P1 組）：在兔腸缺血前10 min 靜脈注射丙泊酚10 mg/kg ，后持續(xù)靜脈注射丙泊酚10 mg/kg/h，余處理同腸I/ R 組；丙泊酚處理組（P2 組）：在兔腸再灌注前10 min 靜脈注射丙泊酚10 mg/kg ，后持續(xù)靜脈注射丙泊酚10 mg/kg/h， 余處理同腸I/R 組；對照組（C 組），即假手術(shù)組。所有兔在實(shí)驗(yàn)過程中，均以乳酸林格液10 mL/kg/h持續(xù)輸注。

1.4 標(biāo)本制備 將實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行全血抽取，然后進(jìn)行低溫下離心，保留上層血漿以待檢測二胺氧化酶（DAO）的含量。選取小腸回盲部15 cm 以上的腸管組織，用冰鹽水進(jìn)行漂凈，濾紙吸干水分后，取部分組織進(jìn)行液氮分裝凍存，用以待檢測小腸組織中的DAO、SOD、MDA 和MPO 。另一部分的小腸組織則用多聚甲醛進(jìn)行組織固定，制備石蠟切片后分別行H-E染色，用TUNEL染色法行細(xì)胞凋亡的檢測。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 腸組織SOD 、MDA 、MPO 的測定 按試劑盒說明書所授方法進(jìn)行測定。

1.5.2 腸組織及血漿DAO 的測定 按黎君友等[5]所用的測定方法進(jìn)行檢測，腸組織蛋白含量測定按北京索萊寶科技有限公司試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.3 小腸損傷程度評分 行H-E染色后，于400×顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（非重疊）來觀察小腸組織的受損程度并進(jìn)行評分， 取其平均值用于統(tǒng)計(jì)。評分為，0 分：正常絨毛與腺體；1 分：部分絨毛頂部上皮輕度受損；2 分：上皮下腺體輕度受損；3 分：上皮下間隙擴(kuò)大， 毛細(xì)血管充血；4 分：上皮與固有層呈中度分離， 腺體受損；5 分：部分絨毛頂部脫落；6 分：絨毛頂部脫落明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張；7 分：絨毛的固有層有脫落， 腺體受損明顯；8 分：固有層開始消化分解。

1.5.4 腸組織細(xì)胞凋亡的TUNEL法檢測 石蠟切片脫蠟入水；蛋白酶K（20 μg/mL，10 mU 溶于TrisHCl 中）37 ℃孵育消化20 min，PBS 洗滌5 min×2 次；滴加TUNEL反應(yīng)混合液， 37 ℃孵育60 min，PBS 洗滌5 min ×3 次；加入 POD 轉(zhuǎn)化液 50 μL ，37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌 5 min ×3 次；加入 DAB 底物 100 μL，室溫顯色10 min ，PBS 洗滌3 次；蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。陽性對照組在加入TUNEL 反應(yīng)混合液之前，先加入DnaseⅠ工作液，于37 ℃條件下孵育35 min ，其余操作采用如上方法。陰性對照組則用不含末端轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記溶液。

結(jié)果判斷：在光鏡下觀察，可見凋亡細(xì)胞的胞核染色為棕褐色，往往深淺相間； 染色質(zhì)則為聚焦?fàn)顟B(tài)或呈核碎片狀。于20×15倍顯微鏡下用數(shù)碼相機(jī)照相。在400倍顯微鏡下，任意選取5個(gè)非重疊視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)目，然后取其平均數(shù)值以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s） 表示，組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）人方法，以P＜0 .05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿和腸組織二胺氧化酶（DAO）活性 血漿及腸組織DAO水平與對照組（C組）相比，其他3組中血漿的DAO 水平均有不同程度的升高，但僅在缺血再灌注組（I/R組）有顯著性差異（P＜0.01）；而其他3組腸組織DAO的 水平則都有所下降， 但僅在I/R 組有顯著性差異（P＜0.05）； 丙泊酚預(yù)處理組（P1組）中腸組織DAO 水平高于I/R組和P2 組， 與I/R 組相比較則有顯著性差異（P＜0.01）。見圖1。

圖1 血漿和腸組織二胺氧化酶（DAO）活性

2.2 小腸損傷評分和細(xì)胞凋亡記數(shù) 在H-E染色后于光鏡下觀察，對照組（C組）的小腸黏膜形態(tài)基本正常。而其余3 組小腸黏膜則有多部位不同程度絨毛上皮脫落，毛細(xì)血管的擴(kuò)張和淤血，黏膜下組織水腫等腸黏膜的損傷，3組損傷程度評分都非常顯著地高于C 組（均P＜0.01），3 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2a。于光鏡下進(jìn)行觀察，C 組僅見少數(shù)細(xì)胞凋亡情況的發(fā)生。腸缺血再灌注組后則細(xì)胞凋亡情況明顯加重， 其余3 組與C 組比較有顯著性差異，缺血再灌注組最為嚴(yán)重（P＜0.01）。使用丙泊酚預(yù)處理后兔小腸細(xì)胞凋情況有所減輕， P1 組與I/R 組比較有顯著性差異（P＜0.01）。見圖2b。

圖2 小腸損傷評分和細(xì)胞凋亡記數(shù)

注：與C組比較，*P＜0.05；與C組比較，**P＜0.01；與I/R組比較，## P＜0.01

2.3 腸組織SOD、MDA、MPO變化 與對照組（C組）相比較， 另3組兔腸組織的SOD 活性下降，MDA 水平有所升高， MPO 活性亦升高， 在缺血再灌注組（I/R組）差異有顯著性差異（SOD：P＜0.01，MDA：P＜0.05，MPO：P＜0.05）。圖3a、3b、3c。P1 組SOD 活性和MDA水平與I/R 組比較差異有顯著性意義（均P＜0.05），而在P1與P2 組則改變情況略有減輕。見圖3a、3b。

圖3 各組腸組織SOD，MDA，MPO水平

3 討論

腸道黏膜組織對缺血、缺氧表現(xiàn)出異乎尋常的敏感，短時(shí)間的缺血和缺氧即可造成腸黏膜功能的損害，進(jìn)而破壞腸黏膜的屏障功能，造成細(xì)菌移位（bacteria translocation），從而損害機(jī)體的生理功能。已有研究表明，對于腸系膜上動脈（SMA）阻閉1 h后，再給予3 h灌注，可造成明顯的小腸上皮細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是I/R損傷引起腸黏膜細(xì)胞死亡的主要方式。因此，丙泊酚對小腸I/R所致腸粘膜損傷的保護(hù)作用可能至少部分歸因于預(yù)防腸粘膜細(xì)胞凋亡。

二胺氧化酶（DAO），又被稱為組胺酶，是一種與代謝、氧化及組胺代謝相關(guān)的酶。通常情況下，在人類或哺乳動物的的消化道中，DAO的表達(dá)相當(dāng)活躍；而在血液循環(huán)系統(tǒng)中，則DAO的含量微乎其微。而在消化道尤其是腸黏膜受到損害時(shí)，DAO可從組織中進(jìn)入血液循環(huán)當(dāng)中，從而引起血漿中DAO含量的增高。消化道中的DAO也可由于組織破壞而有所升高。因此，當(dāng)血漿和/或消化道中DAO含量升高時(shí)，就暗示有可能消化道黏膜細(xì)胞的損害發(fā)生。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比較，兔腸缺血再灌注（I/R）后， 腸組織內(nèi)的DAO 活性明顯降低，而血漿中的DAO 活性則顯著升高——此種情況說明在小腸I/R 后有黏膜細(xì)胞受損并發(fā)生脫落。光鏡下H-E染色顯示，缺血再灌注（I/R）后小腸出現(xiàn)明顯的黏膜組織水腫、毛細(xì)血管血液淤滯等情況，與對照組相比損傷情況明顯增高。進(jìn)而行原位細(xì)胞凋亡檢測，顯示缺血再灌注（I/R）兔腸組織細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多。這些結(jié)果表明，兔腸缺血再灌注（I/R）后，小腸黏膜組織受到明顯的損害，黏膜細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致腸缺血/再灌注損傷的主要因素之一。在我們的研究中，腸I/R損傷與損傷組SOD活性顯著降低和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA增加有關(guān)。丙泊酚治療可提高SOD活性，降低MDA的生成。Yagmurdur等人最近的一項(xiàng)研究表明，丙泊酚，但不是靜脈麻醉的氯胺酮，可防止燒傷引起的脂質(zhì)過氧化增加和減少大鼠腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡，這種作用可能歸因于丙泊酚的抗氧化特性[6]。

在給予丙泊酚后，缺血再灌注后的腸組織受損情況雖然并無顯著性的降低，但在組織中， DAO活性的下降幅度則有所減少；而在血漿中，DAO的上升幅度同樣有所減少。而在丙泊酚預(yù)處理組（P1組）中的情況為腸組織 的DAO活性明顯高于缺血再灌注（ I/ R）組。這充分說明在使用丙泊酚后，兔腸組織在缺血再灌注時(shí)，發(fā)生的腸絨毛組織破壞明顯減少。經(jīng)腸組織原位細(xì)胞凋亡的檢測則顯示，經(jīng)丙泊酚預(yù)處理的兔腸黏膜細(xì)胞凋亡的數(shù)目比缺血再灌注（I/R）組減少，在 P1組差異有顯著性意義。以上情況表明，應(yīng)用丙泊酚預(yù)處理可以減輕兔腸缺血再灌注（I/R）后腸組織的損害。而在腸組織損傷發(fā)生、發(fā)展過程中，腸組織和血漿中的腸黏膜標(biāo)記酶 DAO的變化要早于形態(tài)學(xué)改變。因此，通過對血漿和腸組織中DAO變化的測定，則可以反映腸損害的發(fā)展情況和程度。

丙泊酚對組織的保護(hù)作用可能通過如下機(jī)制發(fā)生作用：1）抗氧化作用。丙泊酚是一種極好的自由基清除劑，在體內(nèi)和體外研究都表明它能增強(qiáng)各種組織的抗氧化能力。這種丙泊酚效應(yīng)的機(jī)制尚不清楚，但它可能歸因于丙泊酚的預(yù)處理樣效應(yīng)，如我們之前所描述的。I/R可損傷腸屏障，進(jìn)而引起腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-6等促炎細(xì)胞因子的釋放。研究表明，丙泊酚在體內(nèi)和體外均可減弱細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6）對內(nèi)毒素血癥的反應(yīng)[7-8]。2）抑制炎性細(xì)胞反應(yīng)?；钚匝鹾脱踝杂苫囊粋€(gè)重要來源是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。這些炎性細(xì)胞在呼吸爆發(fā)過程中釋放活性氧和氧自由基以對抗入侵的細(xì)菌。雖然這種活性氧和氧自由基的產(chǎn)生可有效地殺滅或抑制侵入機(jī)體的細(xì)菌，但是過度的產(chǎn)生因炎癥反應(yīng)過重而導(dǎo)致局部組織損傷。因此，炎性細(xì)胞在腸I/R損傷中的過度活躍可引起組織的損傷。消除多余的活性氧和超氧化物歧化酶，可能是治療腸道I/R損傷的備選方案之一。總之，我們的研究表明，在動物模型中使用鎮(zhèn)靜劑量的丙泊酚治療或預(yù)處理，可以減輕腸I/R誘導(dǎo)的腸粘膜損傷。當(dāng)丙泊酚用于心臟大手術(shù)后的有意識鎮(zhèn)靜或用于有胃腸缺血危險(xiǎn)的危重病人時(shí)，需要進(jìn)一步研究以確定這種治療作用在臨床上的效果。目前的結(jié)果支持了我們先前的假設(shè)，即丙泊酚在發(fā)揮鎮(zhèn)靜效用的同時(shí)，亦可產(chǎn)生麻醉預(yù)處理的有益效果。