王天寧，萬志強(qiáng)，趙 彧，苗 磊，張榮榕，衣春光，樸松蘭

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，長春 130017；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，長春 130017；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130017；4.長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長春 130017）

氧是人體新陳代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，是一切生命活動的第一需要，長期慢性缺氧，會使組織細(xì)胞活力降低，器官功能減退，免疫力下降，使原有疾病惡化。由于我國缺氧人群覆蓋范圍越來越廣，已經(jīng)嚴(yán)重影響居民的生活質(zhì)量，所以對于如何選擇一種關(guān)于提高缺氧耐受力方面合適的治療方式則變的尤為重要。目前西醫(yī)主要根據(jù)不同器官或不同部位缺氧癥狀進(jìn)行相對應(yīng)的補(bǔ)氧物理治療及補(bǔ)氧化學(xué)藥物治療，物理治療主要采用高壓氧艙?；瘜W(xué)藥物治療主要采用藥物進(jìn)行調(diào)控，如采用擴(kuò)血管藥物氟桂利嗪、倍他司汀進(jìn)行治療；中醫(yī)在治療“缺氧”方面，其治療方法分為外用手法治療及內(nèi)服中藥治療，其中手法治療主要是采用針灸治療來緩解腦部缺氧癥狀。內(nèi)服中藥治療往往是依據(jù)中醫(yī)辯證施治理論，通過“陰陽平衡、氣血雙補(bǔ)”的法則進(jìn)行治療。運(yùn)用中藥藥性、功效及君臣佐使配伍規(guī)律，結(jié)合臨床實(shí)踐，選取具有耐缺氧作用的中藥材如人參、丹參、枸杞、紅景天等中藥材，進(jìn)行辨證施治的內(nèi)服配伍中藥治療。

復(fù)方增氧方以人參-丹參藥對為基礎(chǔ)[1]，通過與長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心腦內(nèi)科，呼吸內(nèi)科等中醫(yī)名家共同協(xié)商，根據(jù)中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)及文獻(xiàn)依據(jù)，確定加味有著“高原人參”美譽(yù)的紅景天藥材進(jìn)行組方，其臨床應(yīng)用表明具有良好的耐缺氧作用。運(yùn)用現(xiàn)代藥理方法以缺氧小鼠模型、亞硝酸鈉中毒小鼠模型和急性腦缺血小鼠模型為受試對象，系統(tǒng)探討該增氧方提高缺氧耐受力藥效，在此基礎(chǔ)上，為了弄清該增氧方的藥效物質(zhì)，采用血清藥物化學(xué)方法，探討了該增氧方在大鼠體內(nèi)的藥效物質(zhì)，為將其開發(fā)成高科技含量的保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 1）SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（230±10）g，雄性。購于長春宏達(dá)鼠廠，生產(chǎn)許可證號SCXK（吉）2008-0002。2）SPF級小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雄性。購于長春宏達(dá)鼠廠，生產(chǎn)許可證號SCXK（吉）2008-0003。3）昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半。購于由長春宏達(dá)鼠廠，生產(chǎn)許可證號SCXK（吉）2014-0003。

1.2 試劑及儀器 1）試劑：復(fù)方增氧方、紅景天藥材、丹參藥材、人參藥材、紅景天膠囊、紅景天苷對照品、酪醇對照品、隱丹參酮對照品、丹參酮IIA對照品、丹參酮I對照品、人參皂苷Re 對照品、凡士林、鈉石灰、亞硝酸鈉。2）儀器：ALB-224萬分之一分析天平（德國賽多利斯公司）；Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB265-S十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；微型旋渦混合儀（VORTEX MIXER）；高速電動勻漿機(jī)（新寶儀器有限公司）；離心機(jī)（eppendprf AG）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 供試品制備 日服處方量為：紅景天4 g，丹參3 g，人參1 g。取丹參藥材，加5倍量65%乙醇，90 ℃回流提取2次，1 h/次；人參、紅景天藥材加6倍量70%乙醇，回流提取3次，1次/h；丹參、人參、紅景天藥渣：加7倍量水100 ℃煎煮1次，1 h、濃縮、減壓干燥（60～80 ℃）、粉碎，過80目篩，藥粉備用（8 g生藥量相當(dāng)于藥粉2.4 g）。以蒸餾水調(diào)配至所所需濃度。

2 方法

2.1 耐缺氧實(shí)驗(yàn)

2.1.1 常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 取雄性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只分別為空白組、陽性藥組（紅景天膠囊）、復(fù)方增氧方低劑量組、復(fù)方增氧方中劑量組、復(fù)方增氧方高劑量組，空白組給予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥30 h。將各組小鼠末次灌胃給藥1 h后，分別放入有5 g鈉石灰的250 mL廣口瓶內(nèi)，瓶口用凡士林涂抹蓋嚴(yán)，以保持密閉不透氣，以小鼠呼吸停止為指標(biāo)，觀察記錄自小鼠放入瓶中起到小鼠死亡的時間[2]。通過對組方中藥材提取濃縮處理最終得出提取物服用量為2.4 g/d相當(dāng)于生藥量8 g/d。按正常人體質(zhì)量為60 kg計(jì)算，每kg體質(zhì)量日服生藥量為8/60 = 0.133 g·kg-1·d-1。以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組則小鼠劑量為 0.133×10 = 1.333 g·kg-1·d-1。將 1.333 g·kg-1·d-1確定為中劑量，則其2倍為高劑量，其1/2為低劑量。具體給藥量見表1。

表1 小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn)給藥量

2.1.2 亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn) 取雄性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分組情況同2.1.1項(xiàng)下，空白組給予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥30 h。各組小鼠末次灌胃給藥1 h后，每只小鼠腹腔注射給予220 mg/kg亞硝酸鈉，立即計(jì)時，記錄小鼠存活時間[3]。

2.1.3 急性腦缺血實(shí)驗(yàn) 取雄性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分組情況同2.1.1項(xiàng)下，空白組給予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥30 h。各組小鼠末次灌胃給藥1 h后，自頸部逐只斷頭，立即記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時間。小鼠斷頭后迅速于冰盒上取血腦組織，去除嗅球，濾紙吸干稱重，加9倍冰凍生理鹽水，用高速電動勻漿機(jī)勻漿，制成10%勻漿液，3000 r/min離心15 min，將離心好的勻漿取上清，用生理鹽水按1：9稀釋成1%腦組織勻漿液分裝到錐形瓶中備用。測定SOD和MDA的含量[4]。

2.1.4 小鼠游泳實(shí)驗(yàn)及相關(guān)指標(biāo)測定 取雄性小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，分組情況同2.1.1項(xiàng)下，空白組給予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃給藥30 d。小鼠末次灌胃給藥1 h后，放入水溫（22±1）℃，水深30 cm的游泳池中，游泳20 min后，處死小鼠，收集小鼠肝臟組織，將肝組織勻漿，測定肝臟中SOD和MDA的含量[5-6]。

2.2 小鼠急性毒性試驗(yàn) 選用昆明種小鼠20只，雌雄各半進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)期間，動物自由攝食和飲水，采取灌胃法給予受試物，樣品最大使用濃度為0.4 g/mL。稱取藥粉16.00 g，加無菌水至40 mL，灌胃容量為20 mL/kgBW，即以8.00 g/kgBW的劑量，灌胃2次，間隔6 h。灌胃劑量相當(dāng)于16.00 g/kgBW（相當(dāng)于人推薦日攝入量的400倍）。連續(xù)觀察14 d ，觀察并記錄動物的一般狀態(tài)，體重變化，中毒特征以及死亡情況等，測定最大耐受劑量（MTD）。

2.3 血清藥物化學(xué)初步研究

2.3.1 樣品制備 1）供試品制備：復(fù)方增氧方提取物的制備同1.3項(xiàng)下制備方法，并同法提取紅景天藥材陰性、丹參藥材陰性、人參藥材陰性、單味紅景天藥材、單味丹參藥材、單味人參藥材提取物。2）混合對照品制備：精密取紅景天苷2.09 mg，酪醇 1.97 mg，隱丹參酮1.98 mg，丹參酮I 2.04 mg，丹參酮IIA 2.51 mg，人參皂苷Re 1.97 mg，置2 mL容量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，定容，0.45 um微濾膜過濾，制得混合對照品溶液。

2.3.2 給藥方法 取正常的SD大鼠70只，隨機(jī)分為7組，即空白組、單味紅景天藥材組、單味丹參藥材組、單味人參藥材組、復(fù)方增氧方提取物高劑量組、復(fù)方增氧方提取物中劑量組、復(fù)方增氧方提取物低劑量組，每組10只。每組給藥量見下表。1次/d，連續(xù)7 d；空白組給與等量蒸餾水灌胃。末次給藥前12 h禁食，自由飲水。給藥量按人每天生藥量乘以大鼠比例系數(shù)6.25。見表2。

表2 各組大鼠給藥量表

2.3.3 試樣處理及檢測 分別采取末次給藥后30 min、60 min、90 min、120 min的血清。取含藥血清1 mL置10 mL離心管中，加入硫酸銨0.36 g，快速混勻，分別加甲醇（1 mL/次，總計(jì)5 mL）充分混勻，12000 r/min離心10 min，上清液置80 ℃水浴鍋上蒸干，用微量移液器精密加入0.5 mL，并使殘?jiān)浞秩芙猓?.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，備用。 取同法處理好的含藥血清樣品、空白血清樣品、混合標(biāo)準(zhǔn)品、空白溶劑進(jìn)入液相色譜儀，于高效液相色譜儀中進(jìn)行測定。色譜條件：1）色譜柱：Alltima-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；2）流動相：乙腈（A）-水（B）；3）梯度洗脫：0～ 13 min，7.0% A；13～ 16 min，7.0% ～ 17.0%A；26～ 39 min，17.0% ～ 27.0%A；39～ 72 min，27.0%～50.0% A；72～84 min，59.0%～53.0% A；84～150 min，53% A；4）檢測波長：0～34 min，283 nm；34～55 min，223 nm；55～150 min，283 nm；5）體積流量：1 mL/min；6）柱溫：35 ℃；7）進(jìn)樣量：20 μL。

2.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證 1）精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按照2.3.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以隱丹參酮為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD值，結(jié)果表明18個共有峰的相對保留時間小于0.4%、相對峰面積的RSD均小于2%。說明儀器的精密度良好[7]。2）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品6份，按照2.3.3項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液、色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以隱丹參酮為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD值，結(jié)果表明，18個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均＜2%。說明該方法重復(fù)性良好。3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，按照“2.3.3項(xiàng)下色譜條件”連續(xù)進(jìn)樣6次，收集3、6、9、12、15、18小時色譜圖，以隱丹參酮為參照峰，計(jì)算共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD值，結(jié)果顯示，18個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD均＜2%。表明樣品的穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方增氧方對小鼠耐缺氧存活時間的影響 連續(xù)灌胃給藥30 d，與空白組比較，復(fù)方增氧方中、高組和陽性藥對照組小鼠存活時間均顯著增強(qiáng)，P＜0.05或P＜0.01，表明復(fù)方增氧方具有提高缺氧耐受力作用。見表3。

表3 小鼠耐缺氧存活時間比較

3.2 對腦組織及肝組織中SOD和MDA含量的影響 與空白組比較，復(fù)方增氧方中、高組和陽性藥對照組小鼠腦組織及肝組織中SOD顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

表4 小鼠腦組織、肝組織中SOD和MDA含量

3.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 復(fù)方增氧方對2種性別的小鼠經(jīng)口的最大量耐受劑量（MTD）均＞15 g/kgBW。急性毒性分級屬無毒級。見表5。

表5 小鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 血清藥物化學(xué)相關(guān)成分判定 通過對采血時間進(jìn)行對比研究發(fā)現(xiàn)，60 min采血圖譜（圖1）可以檢測到的色譜峰較多，且峰形較明顯，基線較平穩(wěn)，分離度較好，因此可以確定采血時間點(diǎn)為大鼠給藥后60 min。通過藥材圖譜比對法判斷出9個入血的原型成分，1～3、6號峰來自于紅景天藥材，8～10號峰來自于丹參藥材，7號峰來自于人參藥材，4號峰為三中藥材血清共有峰，并通過對照品圖譜（圖2）比對指認(rèn)出1、2、8、9、10號峰分別為紅景天苷、酪醇、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA。

圖1 色譜比對圖

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

4 討論

復(fù)方增氧方在臨床上應(yīng)用，有良好藥效。急性毒性試驗(yàn)表明其安全無毒，藥效試驗(yàn)表明，小鼠在常壓缺氧條件下，受缺氧因素?fù)p害，酸性代謝產(chǎn)物和二氧化碳蓄積，最終因腦組織缺氧而死亡。復(fù)方增氧方能顯著延長小鼠存活時間，說明有降低耗氧量的作用。亞硝酸鈉中毒實(shí)驗(yàn)中，亞硝酸鈉為一種氧化劑，進(jìn)入機(jī)體可使血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白，失去攜氧能力，最終導(dǎo)致機(jī)體器官、組織供氧不足而死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)方增氧方可顯著延長亞硝酸鈉中毒小鼠的存活時間，說明復(fù)方增氧方能提高對缺氧的耐受力。小鼠在急性腦缺血實(shí)驗(yàn)斷頭后，腦供血中斷，腦組織內(nèi)部貯存的一定能量可使斷頭小鼠維持一段時間的張口喘息，該模型簡單易行，是篩選藥物的有效方法。SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶之一，可清除氧自由基，復(fù)原因自由基造成細(xì)胞傷害，從而減少神經(jīng)細(xì)胞損傷[5]。MDA是膜脂過氧化最終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性[8]。急性腦缺血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方增氧方顯著延長小鼠斷頭后張口喘息時間。并通過增加SOD含量，降低MDA含量，來提高小鼠耐缺氧及抗氧化作用。

采用血清藥物化學(xué)方法對復(fù)方增氧方藥效物質(zhì)進(jìn)行測定，研究了灌胃給與大鼠一定量的耐缺氧方溶液后，通過自身代謝與吸收觀察藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后在血液中的原型成分與代謝成分，從而能夠進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)藥物起效的具體成分。研究表明通過HPLC-DAD保留時間對照法，判斷出9個入血的原型成分，并且指認(rèn)出其中1、2、8、9、10號峰分別為紅景天苷、酪醇、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA；針對這9個原型入血成分，與各藥材及其陰性樣品的血清色譜圖進(jìn)行比對，將已確認(rèn)出的9個原型成分進(jìn)一步進(jìn)行了藥材的歸屬，同時本實(shí)驗(yàn)也對其給藥高、中、低劑量組的血清色譜圖進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，隨著給藥劑量的增加，這些原型入血成分的含量也呈成正相增加，由此得出，作為君藥的紅景天，其起效成分主要為紅景天苷與酪醇，臣藥丹參的主要起效成分隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA，而人參中的人參皂苷作為有效成分可能是通過其代謝產(chǎn)物起效的，有文獻(xiàn)報道人參皂苷并不是完全以原藥形式吸收入血，而是通過酸堿水解、腸道菌群代謝或肝臟代謝變成水解物或代謝物，進(jìn)而產(chǎn)生療效。故在考察人參皂苷的體內(nèi)作用時，不能僅考慮原型藥物的作用，還要考慮其在體內(nèi)是否代謝，代謝產(chǎn)物是否有活性及其活性強(qiáng)弱等因素[9]。