魏曉露，李月紅，李國霞

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2.天津南開醫(yī)院腎內(nèi)科，天津 300100 ；3.天津醫(yī)科大學(xué)國際醫(yī)學(xué)院，天津 300070 ）

腎纖維化（renal fi brosis，RF）是慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的重要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康，有效干預(yù)纖維化的發(fā)生、發(fā)展，已受到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[1-2]。蚓激酶是中藥地龍中具有蛋白水解作用的單體成分，有激活抗凝，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)等作用，臨床上主要用于防治心腦血管病、下肢深部靜脈血栓、腎病綜合征等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)蚓激酶可有效阻抑UUO大鼠腎纖維化的進(jìn)展[3]。基于前期研究，本實(shí)驗(yàn)從體外細(xì)胞角度，探討蚓激酶對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）刺激的人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）細(xì)胞膠原蛋白Ⅰ（ColⅠ）、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）、NADPH氧化酶4（NOX4）表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2），由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研究所惠贈；蚓激酶購自北京普天同創(chuàng)公司（規(guī)格：26000 U/支）；鹽酸貝那普利購自北京諾華制藥有限公司；MTT購自Amresco公司；TGF-β1、DMSO、RIPA裂解液均購自Sigma公司；一抗 ColⅠ、PAI-1、NOX4、GAPDH兔抗大鼠單克隆抗體，二抗山羊抗兔 IgG均購自proteintech公司；TRIpure試劑購自艾德萊公司；cDNA合成試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增預(yù)混合溶液均購自novoprotein公司。

1.2 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；倒置顯微鏡CKX41（Olympus）；酶標(biāo)儀（Thermo Varioskan）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜裝置（美國 Bio-Rad）；熒光PCR儀器ABI7500（美國ABI）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的HK-2復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12（加入100 U/L鏈霉素和100 U/L青霉素）培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液，約培養(yǎng)3~4 d細(xì)胞融合至90%以上后可傳代培養(yǎng)。

2.2 藥物配制 將蚓激酶用含血清培養(yǎng)液溶解配置成1200 U/mL的貯存液TGF-β1用含血清培養(yǎng)液溶解配置成1 mg/mL的貯存液；鹽酸貝那普利用DMSO助溶，用含血清培養(yǎng)液配置成終濃度為100 μmoL/L的貯存液，其中DMSO的終濃度≤0.5%。

2.3 MTT法檢測不同劑量蚓激酶對HK-2活性的影響 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個(gè)/mL，在96孔板中每孔加入100 uL細(xì)胞懸液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將96孔板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱， 待貼壁后給藥（設(shè)蚓激酶7個(gè)質(zhì)量濃度：20、40、60、80、100、120、140 U/mL）；給藥后細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，藥物作用結(jié)束后，每孔加入 20 uL的MTT（5 mg/mL）；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 uL DMSO，37 ℃溫箱孵育 10 min后，用酶標(biāo)儀檢測單波長為490 nm處各孔的光密度（OD）值。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 1）正常組；2）模型組：TGF-β1+培養(yǎng)液；3）貝那普利組：TGF-β1+鹽酸貝那普利（10 μmol/L）+培養(yǎng)液；4）蚓激酶低劑量組：TGF-β1+蚓激酶（30 U/mL）+培養(yǎng)液；5）蚓激酶中劑量組：TGF-β1+蚓激酶（60 U/mL）+培養(yǎng)液；6）蚓激酶高劑量組：TGF-β1+蚓激酶（120 U/mL）+培養(yǎng)液。其中TGF-β1提前 30 min作用于細(xì)胞，TGF-β1的終濃度為10 μg/mL，培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)檢測。

2.5 Western blotting 法檢測 PAI-1、NOX4、ColⅠ的蛋白含量 RIPA裂解液提取總蛋白，將各組蛋白調(diào)至相同濃度后上樣，SDS-PAGE電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶37 ℃封閉3 h，一抗（1：2000稀釋）4 ℃孵育過夜，漂洗后，加入二抗（1：10000稀釋）37 ℃孵育l.5 h，最后加入ECL在儀器中顯色。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件對特異性條帶做定量分析，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參的吸光度值比反映蛋白相對表達(dá)量。

2.6 熒光定量PCR檢測PAI-1、NOX4、ColⅠ的基因表達(dá) TRIpure 試劑提取各組細(xì)胞總RNA，鑒定RNA純度；按照試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成。PCR引物序列為：

ColⅠ上游5’- GGAGAGAGCATGACCGATGG -3’，

下游5’- GAATCGACTGTTGCCTTCGC -3’；

PAI-1上游5’- CTTCATGGGGCAAGTGATG-3’，

下游5’- TCTCCAGTTTCGTCCAAATGA-3’；

NOX4上游5’- CTTGGTGAATGCCCTCAACT-3’，

下游：5’-TCAGACCAGGAATGGTTG TG-3’；

GAPDH上游5’-CCTTCCGTGTTCCTACCC-3’，

下游5’-AAGTCGCAGGAGA CAACC-3’。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性15 min、95 ℃變性10 s、50 ℃退火/延伸30 s、循環(huán)40次，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)果以Ct值表示，采用2-ΔΔCt法對目的基因進(jìn)行相對定量分析。

3 結(jié)果

3.1 蚓激酶對HK-2活性的影響 MTT法顯色深淺隨孔板中活細(xì)胞數(shù)增加而逐漸加深，其光密度值（OD）亦隨之升高。計(jì)算半數(shù)抑制率（IC50）， IC50約為蚓激酶濃度120 U/mL的加藥濃度。見表1。

表1 蚓激酶對HK-2活性的影響（± s ，n = 6）

表1 蚓激酶對HK-2活性的影響（± s ，n = 6）

注：n為重復(fù)次數(shù)

組 別 劑量/（U/mL） OD值 抑制率/%正常組 - 0.57±0.34 0蚓激酶20 0.55±0.19 3.5 40 0.50±0.10 12.3 60 0.44±0.23 22.8 80 0.37±0.02 35.1 100 0.35±0.02 38.6 120 0.29±0.14 49.1 140 0.28±0.15 50.8

3.2 蚓激酶對TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞ColⅠ、PAI-1、NOX4的蛋白含量的影響 模型組中HK-2經(jīng)TGF-β1刺激后，與正常組比較，模型組ColⅠ、PAI-1、NOX4的蛋白含量均比正常組升高（P＜0.05）；貝那普利組及蚓激酶低、中、高劑量組ColⅠ、PAI-1、NOX4的蛋白含量均比模型組降低（P＜0.05）。見圖1、表 2。

圖1 ColⅠ、PAI-1、NOX4及內(nèi)參GAPDH的蛋白表達(dá)

表2 各組HK-2細(xì)胞ColⅠ、PAI-1、NOX4的蛋白表達(dá)情況（± ，n = 3）s

表2 各組HK-2細(xì)胞ColⅠ、PAI-1、NOX4的蛋白表達(dá)情況（± ，n = 3）s

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；n為重復(fù)次數(shù)

組 別 ColⅠ PAI-1 NOX4正常組 0.07±0.01△ 0.36±0.03△ 0.41±0.03△模型組 1.14±0.12# 1.06±0.09# 1.13±0.09#貝那普利組 0.40±0.02#△ 0.58±0.06#△ 0.71±0.11#△蚓激酶低劑量組 0.97±0.07#△ 0.60±0.04#△ 0.92±0.02#△蚓激酶中劑量組 0.71±0.08#△ 0.59±0.05#△ 0.79±0.06#△蚓激酶高劑量組 0.70±0.02#△ 0.43±0.02#△ 0.75±0.02#△

3.2 蚓激酶對TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞ColⅠ、PAI-1、NOX4的基因表達(dá)影響 與正常相比，模型組ColⅠ、PAI-1、NOX4基因表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05），在給藥不同濃度的蚓激酶和貝那普利均能明顯下調(diào)ColⅠ、PAI-1、NOX4基因表達(dá)（P＜0.05）。見表3。

表3 各組HK-2細(xì)胞ColⅠ、PAI-1、NOX4的基因表達(dá)情況（± s ，n = 3）

表3 各組HK-2細(xì)胞ColⅠ、PAI-1、NOX4的基因表達(dá)情況（± s ，n = 3）

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；n為重復(fù)次數(shù)

組 別 ColⅠ PAI-1 NOX4正常組 1.00±0.00△ 1.00±0.00△ 1.00±0.00△模型組 4.31±0.32# 2.01±0.59# 3.08±0.47#貝那普利組 2.47±0.05#△ 1.36±0.01#△ 1.72±0.06#△蚓激酶低劑量組 3.60±0.62#△ 1.76±0.23#△ 2.21±0.17#△蚓激酶中劑量組 3.16±0.14#△ 1.59±0.36#△ 1.98±0.25#△蚓激酶高劑量組 2.77±0.33#△ 1.43±0.27#△ 1.81±0.22#△

4 討論

地龍作為一種蟲類藥，具有搜風(fēng)通絡(luò)、活血祛瘀的功效[4]，蚓激酶是從地龍?bào)w內(nèi)提取的一組絲氨酸蛋白酶，因其溶栓能力強(qiáng)、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢而得到廣泛關(guān)注。蚓激酶的藥理作用是多方面的，包括激活抗凝，纖溶，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)、抗腫瘤、抗炎等。有實(shí)驗(yàn)研究表明，蚓激酶對肺纖維化、心纖維化有一定的療效[5-6]，然而關(guān)于蚓激酶防治腎纖維化的實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蚓激酶能明顯減輕UUO大鼠腎纖維化的病理改變，降低TGF-β1、α-SMA等纖維化因子的含量[3]。基于前期基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從細(xì)胞層面觀察蚓激酶對腎纖維化的保護(hù)作用。

腎纖維化是各種類型的腎臟病進(jìn)展到終末期的重要病理過程[7-8]，包括肌成纖維細(xì)胞（myof i broblast，MyoFb）增殖和活化、腎小管上皮細(xì)胞凋亡、炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在腎組織內(nèi)過度沉積等[9-11]。腎小管上皮細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化的主要參與者[12-13]，TGF-β1作為經(jīng)典的促纖維化因子[13]，刺激HK-2細(xì)胞后，小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14-15]，使HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MyoFb。MyoFb合成分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原（ColⅠ，Col Ⅲ）、纖維連接蛋白（f i bronectin，F(xiàn)N）增多，加劇ECM的聚集，導(dǎo)致ECM在腎組織的過度沉積，引起腎纖維化。纖溶酶原激活物（PA）和PAI-1是調(diào)節(jié)ECM降解過程中蛋白溶解和抗蛋白溶解的重要參與者[16]，纖溶酶可直接降解ECM，腎內(nèi)PA/ PAI-1平衡失調(diào)可影響纖溶酶生成，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化發(fā)生。Yamaguchi I 等[17]發(fā)現(xiàn)PAI-1表達(dá)上調(diào)還可使腎間質(zhì)MyoFb增多，TGF-β1和ColⅠ表達(dá)增加，而尿激酶活性顯著減低。氧化應(yīng)激在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是氧化應(yīng)激過程中最重要的信號分子[18]，而NOX4產(chǎn)生的ROS是腎纖維化時(shí)腎組織局部ROS的主要來源。NOX4可通過影響腎血流動力學(xué)、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、影響腎小管基底膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、介導(dǎo)TGF-β1各種通路來影響腎纖維化進(jìn)程[19]。腎小管上皮細(xì)胞通過成纖維細(xì)胞活化和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，增加各種炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，最終導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生[20]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HK-2細(xì)胞在TGF-β1刺激下，各組ColⅠ、PAI-1、NOX4蛋白和基因表達(dá)較正常組相比均升高；與模型組相比，蚓激酶各組ColⅠ、PAI-1、NOX4蛋白和基因表達(dá)也均有著不同程度的降低，說明蚓激酶可能是通過糾正纖溶平衡和阻抑氧化應(yīng)激，從而對腎纖維化起到一定的防治作用。然而蚓激酶是通過具體何種通路對腎纖維化起防治作用，需要今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。