何芳梅，任春曉，宋春霞，高惠霞，王晶晶

1.陜西能源職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院康復美容教研室，陜西西安市712000；2.西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安市710077

泛素蛋白酶體系(ubiquitin-proteasome system,UPS)參與動脈粥樣硬化全過程的調(diào)節(jié)[1]，所以UPS的基因多態(tài)性可能增加動脈粥樣硬化和腦梗死的風險。蛋白酶體α6亞單位(proteasome subunitαtype 6,PSMA6)是該體系的一個重要成分，已有許多研究發(fā)現(xiàn)PSMA6基因-8C/G位點(rs1048990)與冠心病、心肌梗死、糖尿病、頸動脈內(nèi)中膜厚度和腦卒中等相關(guān)[2-5]。而對于該基因的其他位點，目前研究卻很少。由于啟動子可通過影響基因表達的起始時間和程度等因素，而在基因表達方面發(fā)揮重要作用，故本文對該基因啟動子1233A/T位點的多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012年1月至2015年4月，收集西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的動脈粥樣硬化性腦梗死患者，均符合第四屆全國腦血管病學術(shù)會議診斷標準，并經(jīng)臨床及CT和/或MRI確診。共納入病例組211例，其中男性120例，女性91例；年齡37～82歲，平均(67.6±7.2)歲。

納入標準：①病程在1周內(nèi)；②漢族。

排除標準：心臟源性腦栓塞(房顫、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脫垂、心臟粘液瘤)、腔隙性腦卒中、動脈炎、外傷、血液病、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤以及藥物等其他原因引起的腦梗死。

取同期該院健康體檢者作為對照組，均為漢族，共201例，其中男性112例，女性89例，年齡36～80歲，平均(66.4±9.0)歲；均無腦卒中史，并經(jīng)過臨床檢查和/或影像學檢查排除腦卒中。

兩組性別和年齡均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。所有標本的收集均經(jīng)患者本人或其家屬同意，并經(jīng)西安醫(yī)學院醫(yī)學研究倫理委員會審核同意。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 血樣本的收集及全血基因組DNA的提取

取早晨空腹靜脈血5 ml，3.8%檸檬酸鈉抗凝，用碘化鉀法提取外周血白細胞的基因組DNA，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)引物及限制性內(nèi)切酶的設(shè)計

根據(jù)PSMA6基因1233A/T位點(DNA序列號NC_000014.9)及其兩側(cè)DNA序列，用NEBcutterV2.0(http：//tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)設(shè)計限制性內(nèi)切酶，該位點合適的限制性內(nèi)切酶為MspI(MBI公司)。應用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0進行PCR引物序列設(shè)計，其評分不低于80分，包含實驗研究的酶切位點并利于酶切結(jié)果分析的引物，并參考通用教材《醫(yī)學分子生物學實驗技術(shù)》中引物設(shè)計原則。引物由上海生工公司合成。

上 游 引 物 ： 5′-TAA ATG GGA GTG TGC CTT GG-3′

下 游 引 物 ： 5′-CAG GAG ATC CAG GTT GCA GT-3′

1.2.3 基因分型

PCR反應體系為15.0μl。其中包括10×Buffer 1.5 μl、dNTP(10 mmol/L)0.3 μl、上下游引物(50 pmol/μl)各 0.2 μl、基因組 DNA 0.5 μl、Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.1 μl、MgCl21.2 μl、dH2O 11.0 μl。

PCR反應條件：95℃熱變性5 min，95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s，擴增40個循環(huán)，72℃延伸6 min，終止反應。取PCR擴增產(chǎn)物10.0 μL、MspI酶0.1 μl、dH2O 3.4 μl及10×Buffer R 1.5 μl，使總體系為15.0μl。37℃酶切7 h。然后行瓊脂糖凝膠電泳，150 V電泳0.5 h，觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行分析。兩組間性別比例差異采用χ2檢驗，年齡以(xˉ±s)表示，差異采用t檢驗?；蛐秃偷任换蝾l率采用基因計數(shù)法計算、Hardy-Weinburg平衡吻合度檢測，基因型和等位基因間差異的統(tǒng)計分析采用χ2檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PSMA6基因1233A/T位點檢測結(jié)果

含有PSMA6基因1233A/T位點的PCR產(chǎn)物是191 bp，經(jīng)MspI酶消化后產(chǎn)生兩個片段分別是132 bp和59 bp。雜合子CT基因型則有三個片段，分別為191 bp、132 bp和59 bp，純合子TT基因型則只有一個片斷大小191 bp，純合子CC基因型有2個片斷大?。?32 bp和59 bp。見圖1。

圖1 Msp I酶酶切PSMA6基因1233A/T位點擴增片段后產(chǎn)物電泳圖

2.2 Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗

兩組人群的PSMA6基因1233A/T位點的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡(P＞0.05)。表明該多態(tài)性位點的基因型分布在所研究的人群中達到了遺傳平衡，具有群體代表性。見表2。

表2 PSMA6基因1233A/T位點基因型分布在兩組人群中的Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗

2.3 PSMA6基因1233A/T位點的基因型及等位基因頻率

兩組CC、CT+TT基因型頻率及C、T等位基因頻率均無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

表3 PSMA6基因1233A/T位點多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性[n(%)]

性別分層后，在男性中，兩組CC(χ2=2.685,P=0.199)、CT(χ2=1.273,P=0.064)、TT(χ2=1.425,P=0.676)基因型頻率及C等位基因(χ2=1.876,P=0.396)頻率均無顯著性差異；在女性中，兩組CC(χ2=1.975,P=0.366)、CT(χ2=2.735,P=0.222)、TT(χ2=2.457,P=0.387)基因型頻率及C等位基因(χ2=0.675,P=0.818)頻率均無顯著性差異。見表4。

3 討論

UPS是體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的重要因素。許多研究顯示UPS通過多種途徑參與動脈粥樣硬化的調(diào)控。首先，核因子 κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)可以調(diào)節(jié)參與動脈粥樣硬化的細胞因子和黏附分子的表達，降解炎癥基因的阻滯子——IκB蛋白[1-6]。UPS可增加NF-κB活性。其次，增加的氧化應激是動脈粥樣硬化重要的病理生理事件，UPS通過Nrf2在內(nèi)皮細胞的氧化應激調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。再次，泡沫細胞是動脈粥樣硬化的重要成分。通過促凋亡分子，UPS可以明顯促進泡沫細胞的形成。而對于這些細胞的退化，也需要一個有功能的UPS。最后UPS還參與動脈粥樣硬化發(fā)展中細胞死亡的分子調(diào)控[7]。

臨床研究也提示泛素在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Divald等[1,8-9]對25例心肌梗死患者進行尸檢，通過免疫組化和半定量分階段測量等方法，發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者動脈粥樣硬化斑塊中，泛素水平更高；在冠狀動脈新生內(nèi)膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)泛素與平滑肌細胞肌動蛋白共存。在實驗動物模型中，還發(fā)現(xiàn)藥物阻滯泛素蛋白酶通路后，通過激活NF-κB，可以明顯減弱腦梗死和動脈粥樣硬化的發(fā)生[2,10]。

表4 1233A/T位點基因型及等位基因頻率與不同性別腦梗死的相關(guān)性

真核細胞內(nèi)的26S蛋白酶體是UPS的重要成分，其核心是一個20S的催化顆粒，后者由α環(huán)和β環(huán)組成。人類的PSMA6基因編碼蛋白酶體α環(huán)的α6亞單位。因為UPS與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，因此PSMA6基因的改變將影響動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

已有許多研究顯示PSMA6基因與動脈粥樣硬化、高血壓、2型糖尿病和心肌梗死相關(guān)[2,11-12]，有理由相信它也與缺血性腦卒中相關(guān)[13]。

Freilinger等[14]對601例德國缺血性腦卒中患者和736例對照者進行研究，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因-8C/G位點與缺血性腦卒中整體和大動脈粥樣硬化性卒中均呈相關(guān)性，GG基因型具有保護作用。Savchuk等[15]對102例烏克蘭缺血性腦卒中患者和92例對照者運用實時PCR方法進行PSMA6基因-8C/G位點的基因型分型，發(fā)現(xiàn)PSMA6基因-8G/G突變體與復發(fā)性缺血性腦卒中相關(guān)。Alsmadi等[16]在1071例沙特阿拉伯冠心病患者和929例對照者組成的研究對象中，通過分子信標為基礎(chǔ)的基因分型分析的方法，對包括KIAA0391和PSMA6在內(nèi)的染色體區(qū)域14q13.2的5個SNPs位點進行分析，發(fā)現(xiàn)2個單倍體型，即1A-2G-3C-4A-5A和1A-2G-3G-4A-5A增加冠心病和心肌梗死的風險。

趙西耀等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)，PSMA6基因rs17458312位點可能與腦梗死的發(fā)病無關(guān)，PSMA6基因rs1048990位點可能與動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病不相關(guān)，但P值接近有統(tǒng)計學意義，值得進一步研究。Zemeckiene等[19]研究發(fā)現(xiàn)在男性受試者中，CG PSMA6 rs1048990基因型在哮喘患者中顯著高于對照組。羅冬[20]研究發(fā)現(xiàn)PSMA6-8C/G位點的多態(tài)性可能不是湖南漢族人群腦卒中發(fā)病的遺傳易感因素。Heckman等[21]研究發(fā)現(xiàn)在隱性模型下，PSMA6(-C8G)基因多態(tài)性可能對缺血性腦梗死起保護作用。需要進一步的前瞻性大規(guī)模流行病學研究來證實不同人群中的這些發(fā)現(xiàn)。

Kakumu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，PSMA6的沉默可誘導癌細胞系的凋亡或G2/M細胞周期阻滯，但不能誘導永生化正常肺細胞系的凋亡或G2/M細胞周期阻滯。這些結(jié)果提示，PSMA6是肺癌有吸引力的靶點，具有較高的治療指數(shù)。Buraczynska等[23]證實PSMA6多態(tài)性可能是終末期腎病的保護因素。另一方面，在終末期腎病患者中，CG+GG基因型與左心室肥厚獨立相關(guān)。Tamasauskiene等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在立陶宛受試者中，盡管他們的蛋白酶體多態(tài)性類型不同，但預計哮喘的發(fā)生頻率相同；然而，其中rs1048990 CG基因型在哮喘男性中更為普遍。常見的基因型多態(tài)性與嗜酸性哮喘表型有關(guān)。綜上所述，針對PSMA6基因多態(tài)性，已有很多研究者從不同角度進行研究。因此，它的基因多態(tài)性與腦梗死之間的關(guān)系有待更深一步、更大規(guī)模的研究。

Sjakste等[25]研究發(fā)現(xiàn) 1233(內(nèi)含子1 1233 A/T)位點的多態(tài)性與心肌梗死相關(guān)。崔少楠等[26]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因第4內(nèi)含子a等位基因可能是冠狀動脈擴張癥發(fā)病的獨立危險因素。但有關(guān)該位點的研究，目前國內(nèi)未見報道。內(nèi)含子的功能現(xiàn)在還沒有完全被探究清楚，但有研究顯示可能與基因表達的調(diào)控有關(guān)，比如在切除一些內(nèi)含子之后某些基因無法表達或者錯誤表達；內(nèi)含子對基因的轉(zhuǎn)錄具有某種調(diào)控作用，比如增強作用或者影響蛋白質(zhì)的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，CC、CT、TT基因型及C等位基因頻率分布在兩組中比較無顯著性差異。性別分層后，各亞組各基因型及等位基因頻率亦均無顯著性差異。故該位點可能與中國漢族人群腦梗死的發(fā)病無關(guān)。目前的研究樣本量不夠大，同時存在抽樣誤差，群體代表性不完全，且可能存在遺傳、種族和環(huán)境因素等作用，該基因型是否與腦梗死發(fā)病相關(guān)，還需通過加大樣本量，進行多中心、不同種族的研究。