趙繼聰， 王 薇， 劉建偉， 馬建欣， 徐德利， 郭靖濤

(1承德市中心醫(yī)院心胸外科, 2承德市第三醫(yī)院放療中心, 3承德市雙灤區(qū)醫(yī)院精神科, 4承德市中心醫(yī)院心內(nèi)科， 河北 承德 067000)

肺癌為常見的肺部惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居所有腫瘤之首[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌之一，約占肺癌的80 %左右，5年生存率很低[2]，該病確診時大多已為中晚期，臨床上多用手術(shù)聯(lián)合化療的治療方案，但其預(yù)后仍不佳。因此，尋找高效的治療藥物及方法意義重大。驅(qū)動蛋白在細(xì)胞中具有重要作用，如胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞分裂等，其在多種人類腫瘤中均具有重要作用。驅(qū)動蛋白家族有40個成員，均含有1個驅(qū)動蛋白域和1個叉頭關(guān)聯(lián)域[3]。驅(qū)動蛋白家族成員C1(kinesin family member C1，KIFC1)為驅(qū)動蛋白14家族中的唯一成員，其存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，具有4個轉(zhuǎn)錄本，20個外顯子，與其它驅(qū)動蛋白家族成員一樣參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。大量研究表明KIFC1參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Xiao等[5]報道，KIFC1通過延遲細(xì)胞周期和保護(hù)癌細(xì)胞存活等途徑促進(jìn)惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，可能為一個潛在的化療靶點(diǎn)。大量研究報道，KIFC1在乳腺癌、胃癌和前列腺癌中均高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6-8]。但KIFC1在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制尚未明確。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已有廣泛研究，其在肺癌發(fā)病機(jī)制中的作用也有報道[9]。miR-105在肝癌和膠質(zhì)瘤中高表達(dá)[10-11]，在前列腺癌中低表達(dá)[12]。有研究報道m(xù)iR-105在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，但其具體的作用機(jī)制尚未完全清楚。本研究將檢測非小細(xì)胞肺癌組織、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-105和KIFC1的表達(dá)，觀察過表達(dá)miR-105、敲減或過表達(dá)KIFC1對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人正常胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5和人NSCLC H460細(xì)胞購自ATCC；組織標(biāo)本為承德市中心醫(yī)院2018年3月～2018年9月手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織(45例)。本研究經(jīng)本醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。BCA蛋白定量試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購于TaKaRa；Transwell小室、基質(zhì)膠、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Sigma。凝膠成像分析儀購于柯達(dá)公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購于BIO-RAD。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 正常胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460均用含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的H460細(xì)胞將細(xì)胞分為miR-105組(轉(zhuǎn)染miR-105 mimics)、miR-NC組[轉(zhuǎn)染mimics陰性對照(negative control,NC)序列]、inhibitor-NC組(轉(zhuǎn)染inhibitor-NC序列)、inhibitor-miR-105組(轉(zhuǎn)染miR-105 inhibitor)、si-KIFC1組(轉(zhuǎn)染KIFC1siRNA)、si-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)、miR-105+vector組(miR-105 mimics和pcDNA 3.1共轉(zhuǎn)染)和miR-105+KIFC1組(miR-105 mimics和pcDNA 3.1-KIFC1共轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取適量對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用TRIzol裂解細(xì)胞后，按RNA抽提試劑盒說明書操作提取RNA，進(jìn)行定量，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書操作合成cDNA。最后按照RT-qPCR試劑盒說明書操作進(jìn)行miR-105和KIFC1 mRNA的檢測。用2-ΔΔCt計算miR-105和KIFC1 mRNA的相對表達(dá)水平。miR-105的上游引物序列為5’-GCCCTCGAGATACCATATCTATCCCCTTTTTCA-3’，下游引物序列為5’-GCCGAATTCCAACCATGAAGATACGAATTGATG-3’; KIFC1 的上游引物序列為5’-TGAGCAACAAGGAGTCCCAC-3’，下游引物序列為5’-TCACTTCCTGTTGGCCTGAG-3’；GAPDH 的上游引物序列為5’-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3’, 下游引物序列為5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’; U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’ 。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 取適量對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用RIPA裂解后提取總蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量后變性，蛋白一樣進(jìn)行SDS-PAGE分離，之后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h，加入Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。次日，洗膜后再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗37 ℃孵育2 h。結(jié)束后加入ECL發(fā)光液，顯影曝光。以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

2.5MTT實(shí)驗(yàn) 取適量對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，加入20 μL MTT(0.5 g/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩，使結(jié)晶充分溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度(A490)值，細(xì)胞活力與細(xì)胞A490呈正相關(guān)。

2.6集落形成實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞生長至75%融合度時，用胰酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。取直徑60 mm的平皿，每個平皿接種1 000個細(xì)胞，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～14 d。當(dāng)平皿底部能用肉眼觀察到小白點(diǎn)時用甲醇固定15 min，然后用吉姆薩染色25 min，最后進(jìn)行集落計數(shù)。

2.7Transwell檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力 取適量對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度。取104個細(xì)胞加入上室內(nèi)，再取600 μL含血清的培養(yǎng)基加入下室，常規(guī)培養(yǎng)過夜。次日，取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌3次，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌3次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞，隨機(jī)取3個視野拍照計數(shù)，取平均數(shù)。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測操作步驟按照細(xì)胞遷移檢測實(shí)驗(yàn)調(diào)整細(xì)胞密度，在小室上表面涂抹適量厚度基質(zhì)膠，然后再加入104個細(xì)胞，后續(xù)操作步驟同上。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取3個視野拍照計數(shù)，取平均數(shù)。

2.8雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn) 取適量對數(shù)生長期細(xì)胞，用TRIzol裂解液裂解，取5 μL裂解液與螢火蟲螢光素酶緩沖液和5 μL底物，混勻用液閃測定儀檢測發(fā)光強(qiáng)度。然后加入海腎螢光素酶緩沖液和5 μL腔腸素底物，混勻，測得海腎螢光素酶活性。psiCHECK2載體以螢火蟲螢光素酶活性為內(nèi)參照，以psiCHECK2-KIFC1-3’UTR WT和psiCHECK2-KIFC1-3’UTR MUT的表達(dá)為對照，觀察miR-105對KIFC1表達(dá)的影響。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，符合正態(tài)分布的計量資料，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量資料，兩組比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組比較采用K檢驗(yàn)，進(jìn)一步通過Nemenyi法進(jìn)行多重比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 非小細(xì)胞肺癌組織中miR-105低表達(dá)、KIFC1高表達(dá)

將非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織分別標(biāo)記為cancer組和adjacent組。與adjacent組相比，cancer組的miR-105表達(dá)顯著降低，KIFC1 的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05); miR-105與KIFC1蛋白的表達(dá)水平在非小細(xì)胞肺癌組織中呈負(fù)相關(guān)，見圖1。

Figure 1. The expression of miR-105 and KIFC1 in the tissues of patients with non-small-cell lung cancer. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsadjacent.

圖1 miR-105和KIFC1在非小細(xì)胞肺癌患者組織中的表達(dá)

2 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-105和KIFC1的表達(dá)

與MRC-5細(xì)胞相比，人非小細(xì)胞肺癌 H460細(xì)胞中KIFC1的mRNA表達(dá)顯著升高，miR-105的表達(dá)顯著降低，KIFC1 的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The expression of miR-105 and KIFC1 in non-small-cell lung cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMRC-5.

圖2 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-105和KIFC1表達(dá)水平的比較

3 過表達(dá)miR-105抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

將miR-NC和miR-105-mimics轉(zhuǎn)染H460細(xì)胞，標(biāo)記為miR-NC組和miR-105組，與miR-NC組相比，miR-105組細(xì)胞中miR-105表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖3A；在72、96和120 h時細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，見圖3B、C，此外，細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量亦顯著降低(P<0.05),見圖3D、E?？梢姡^表達(dá)miR-105抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

Figure 3. Over-expression of miR-105 inhibited the viability, migration and invasion abilities of non-small cell lung cancer cells. A: the expression level of miR-105 in the H460 cells transfected with miR-105 mimics; B and C: over-expression of miR-105 on the proliferation of H460 cells; D and E: over-expression of miR-105 on the migration and invasion abilities of H460 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖3 過表達(dá)miR-105抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

4 敲減KIFC1表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

將si-NC和si-KIFC1轉(zhuǎn)染至H460細(xì)胞，分別標(biāo)記為si-NC組和si-KIFC1組。與si-NC組相比，si-KIFC1組細(xì)胞中KIFC1的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖4A；72、96和120 h時細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，見圖4B、C；此外，細(xì)胞遷移數(shù)量及侵襲數(shù)量亦顯著降低(P<0.05)，見圖4D、E?？梢姡脺pKIFC1的表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

5 KIFC1是miR-105的靶基因

通過TargetScan對miR-105和KIFC1結(jié)合進(jìn)行預(yù)測，miR-105和KIFC1之間存在結(jié)合位點(diǎn),見圖5A。構(gòu)建含有miR-105結(jié)合位點(diǎn)的KIFC1-3’UTR野生型及突變型[以下稱為KIFC1野生型(WT)及突變型(MUT)]報告基因載體，在H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-105 mimics和KIFC1野生型及突變型報告基因載體。用雙螢光素酶報告基因載體實(shí)驗(yàn)檢測H460細(xì)胞的螢光素酶相對活性，與miR-NC組相比，miR-105組WT載體的細(xì)胞螢光素酶相對活性顯著降低，而MUT載體的細(xì)胞螢光素酶相對活性未發(fā)生顯著變化，見圖5B；與miR-NC組相比，miR-105組細(xì)胞KIFC1的mRNA表達(dá)顯著降低，KIFC1的蛋白表達(dá)顯著降低；與inhibitor-NC組相比，inhibitor-miR-105組細(xì)胞KIFC1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，見圖5C、D。可見，KIFC1是miR-105的靶基因。

Figure 4. Knockdown of KIFC1 expression inhibited the proliferation, migration and invasion abilities of non-small cell lung cancer cells. A: knockdown of KIFC1 expression on the protein expression of KIFC1 in H460 cells; B and C: knockdown of KIFC1 expression on the proliferation of H460 cells; D and E: knockdown of KIFC1 expression on the migration and invasion abilities of H460 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssi-NC group.

圖4 敲減KIFC1表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

6 過表達(dá)KIFC1逆轉(zhuǎn)了miR-105對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

與miR-NC組相比，miR-105組的KIFC1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，在72、96和120 h時細(xì)胞的增殖能力均顯著下降(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲能力亦顯著降低(P<0.05)；與miR-105 +vector組相比，miR-105+KIFC1組KIFC1的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，在72、96和120 h時細(xì)胞的增殖均顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力亦顯著升高(P<0.05)，見圖6?？梢姡^表達(dá)KIFC1逆轉(zhuǎn)了miR-105對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。

討 論

越來越多的microRNA被證明在限制腫瘤生長和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用[13]。Lu等[14]在非小細(xì)胞肺癌的研究中運(yùn)用RT-qPCR法檢測正常肺組織和非小細(xì)胞肺癌組織中miR-105-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-105-1在NSCLC中低表達(dá)，且其與患者的總生存率和無病生存率低下有關(guān)。Jin等[15]在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-105可增加A549和Calu-3等細(xì)胞的活力和遷移能力，不影響細(xì)胞凋亡。本研究運(yùn)用RT-qPCR檢測了非小細(xì)胞肺癌組織和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-105的表達(dá)，觀察到miR-105在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，這與Lu等[14]的研究結(jié)果相吻合，但與Jin等[15]人的研究結(jié)果相悖。

KIFC1是一種C型末端驅(qū)動蛋白，在腫瘤細(xì)胞中心體聚集過程中起著不可缺少的作用[16]。已有研究發(fā)現(xiàn)KIFC1在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和前列腺癌等癌中都存在廣泛表達(dá),且與腫瘤發(fā)展和預(yù)后緊密相關(guān)。Han等[17]在肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，KIFC1高表達(dá)，其在體外和體內(nèi)均誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。Liu等[18]運(yùn)用RT-qPCR和Western blot檢測NSCLC組織和癌旁正常肺組織樣本中KIFC1表達(dá)發(fā)現(xiàn)，KIFC1在NSCLC組織中高表達(dá)，且沉默KIFC1可抑制NSCLC細(xì)胞增殖，進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，沉默KIFC1可使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，提示KIFC1可作為肺癌診斷治療的生物標(biāo)志。本研究運(yùn)用RT-qPCR和Western blot檢測了非小細(xì)胞肺癌組織、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中KIFC1 的mRNA和蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，KIFC1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，這與前期的研究結(jié)果相一致。

Figure 5. KIFC1 is the target of miR-105 determined by bioinformatic method and double luciferase reporter assay. A: the complementary sequence; B: the effect of miR-105 on the relative luciferase activity in H460 cells; C: the effect of miR-105 on the mRNA expression of KIFC1 in H460 cells; D: the effect of miR-105 on the protein expression of KIFC1 in H460 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsinhibitor-NC group.

圖5KIFC1是miR-105的靶基因

Figure 6. Over-expression of KIFC1 reversed the inhibitory effect of miR-105 on the proliferation, migration and invasion abilities of non-small cell lung cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsmiR-105+vector group.

圖6 過表達(dá)KIFC1逆轉(zhuǎn)了miR-105對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用

腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移是癌癥患者死亡的主要原因，其通過各種旁分泌和內(nèi)分泌機(jī)制在細(xì)胞之間交換細(xì)胞物質(zhì)是細(xì)胞間信號傳遞的重要手段[19]。腫瘤的生長轉(zhuǎn)移為其高致死率的重要原因。Zhou等[20]研究證實(shí)，miR-105為轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞特有的表達(dá)和分泌，其可促進(jìn)早期乳腺癌細(xì)胞的侵襲，并增加遠(yuǎn)處血管通透性，而在高度轉(zhuǎn)移的腫瘤中miR-105可抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與靶向緊密連接蛋白ZO-1有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-105或敲減KIFC1的表達(dá)均可抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，過表達(dá)KIFC1可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-105對H460細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。

綜上所述，miR-105可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機(jī)制與靶向負(fù)調(diào)控KIFC1有關(guān)。