李 波， 鄭 植， 陳芃螈

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 四川省人民醫(yī)院兒科， 四川 成都 610072)

急性心力衰竭是一種臨床上常見(jiàn)的心血管系統(tǒng)疾病，感染性內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的心力衰竭預(yù)后較單純心力衰竭更差[1]。半數(shù)以上的感染性內(nèi)毒素血癥誘發(fā)心力衰竭與革蘭氏陰性菌有關(guān)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜上的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是其致病的主要原因之一[2]。LPS能夠作用于心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌組織損傷，導(dǎo)致誘發(fā)心力衰竭[3]。APPL1 (adaptor protein, phosphotyrosine interacting with PH domain and leucine zipper 1)在人體內(nèi)的多個(gè)組織和器官中均有表達(dá)，參與介導(dǎo)胰島素信號(hào)傳遞、胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞增殖等生理過(guò)程[4-5]。研究表明，APPL1與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生具有密切關(guān)系，沉默APPL1可以減弱球狀脂聯(lián)素抗缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡作用，提高APPL1表達(dá)可以顯著增加心肌細(xì)胞活力[6-7]。目前對(duì)于APPL1在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)探討過(guò)表達(dá)APPL1對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷的影響，以期為闡明APPL1在心肌損傷中的作用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

TRIzol試劑、RT-qPCR試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TaKaRa；HRP標(biāo)記的IgGⅡ抗購(gòu)自Proteintech；全蛋白提取液購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；過(guò)表達(dá)APPL1重組慢病毒載體和陰性對(duì)照慢病毒載體由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；抗活化的caspase-3(cleaved caspase-3)抗體和APPL1抗體購(gòu)自Stanta Cruz；活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司。

2 方法

2.1LPS對(duì)心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)影響 心肌細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)含有0和1 mg/L LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM)培養(yǎng)，記為對(duì)照(control)組和LPS組。用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中APPL1的表達(dá)變化。

2.1.1RT-qPCR 取control和LPS組的心肌細(xì)胞，在細(xì)胞中添加TRIzol裂解液，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，步驟同逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。取cDNA，以SYBR進(jìn)行定量PCR，β-actin作為內(nèi)參照，分析APPL1的表達(dá)量。設(shè)置PCR條件為：95 ℃反應(yīng)30 s，95 ℃反應(yīng)3 s；60 ℃反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工合成，APPL1的上游引物序列為5’-CAGGGTGGAAATTTAATGAG-3’，下游引物序列為 5’-AGGTGATCTGAAAACAATATC-3’。β-actin 的上游引物序列為 5’-GCAGGAGTA2CGAT-GAGTC-3’，下游引物序列為 5’-ACGCAGCTCAGTAACAGT-3’。

2.1.2Western blot 取control和LPS組的心肌細(xì)胞，在心肌細(xì)胞中添加全蛋白提取液，每5×106個(gè)細(xì)胞中添加500μL的提取液，在4 ℃震蕩30 s后，離心，吸取上清(全蛋白液)。用BCA法對(duì)蛋白定量。在蛋白樣品中以1∶4的體積比添加SDS-PAGE上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。以12%的分離膠、5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，每孔按照40 μg蛋白樣品上樣，上樣后用80 V的恒壓電泳45 min后，再以120 V的電壓電泳1.5 h后結(jié)束電泳。根據(jù)凝膠大小裁剪PVDF膜，在200 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜45 min。把PVDF膜取出后，在5%的牛血清白蛋白中孵育1.5 h后，置于1∶400稀釋的APPL1抗體中，置于4 ℃的冷室中孵育過(guò)夜。再將PVDF膜放在1∶2 000稀釋的Ⅱ抗孵育液中，在室溫結(jié)合1.5 h。ECL發(fā)光，用Konda In-Vivo Imagine System F采集圖像，β-acitn作為內(nèi)參照，用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 心肌細(xì)胞培養(yǎng)密度為40%時(shí)，把培養(yǎng)液上清吸棄，分別添加APPL1重組慢病毒載體和陰性對(duì)照慢病毒載體，同時(shí)加入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑Polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)12 h以后，把病毒液吸棄，添加新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，用1 mg/L的嘌呤霉素篩選4 d。把穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPL1重組慢病毒載體和陰性對(duì)照慢病毒載體的心肌細(xì)胞經(jīng)含有1 mg/L LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后記為L(zhǎng)v-APPL1和Lv-NC。Control和LPS組處理方法同2.1。用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)LPS、Lv-NC和Lv-APPL1組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中APPL1的表達(dá)變化。

2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1組細(xì)胞按照上述各組的分組，分別接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)孔內(nèi)添加5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃孵育4 h，把上清溶液吸棄以后，加入100 μL的DMSO溶液，震蕩反應(yīng)10 min，紫色結(jié)晶溶解以后，測(cè)定570 nm的A值(以空白孔調(diào)零)。相對(duì)活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A÷對(duì)照組A×100%

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化后，配制成單細(xì)胞懸浮液，收集106個(gè)細(xì)胞，以300 μL的結(jié)合緩沖液懸浮以后，添加PI和Annexin V-FITC染液，繼續(xù)加入200 μL的結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化。同時(shí)用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平，步驟同上。

2.5LDH和MDA水平檢測(cè) 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)液上清及細(xì)胞，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量，用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH水平，步驟參照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

2.6SOD和GSH-Px活性檢測(cè) 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，以胰蛋白酶消化后，反復(fù)凍融法將細(xì)胞裂解以后，用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性，5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)比色法測(cè)定細(xì)胞中GSH-Px活性，步驟均同試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平 取control、LPS、Lv-NC和Lv-APPL1細(xì)胞按照上述各組的分組，培養(yǎng)24 h后，用4 ℃預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌3次以后，添加0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，添加10 μmol/L的DCFH-DA染液500 μL，置于37 ℃孵育30 min后，離心棄上清，用冰預(yù)冷的PBS洗滌以后，配制成1×108/L的懸浮液，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗(yàn)，多組差異比較用單因素方差，組間比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS降低心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)LPS處理以后，細(xì)胞中的APPL1 mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，LPS抑制心肌細(xì)胞中APPL1的表達(dá)，見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1. Western blot was used to detect the expression level of APPL1 in LPS-induced cardiomyocytes.

圖1 Western blot檢測(cè)APPL1在LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平

表1 LPS處理后心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

Table 1. Expression of APPL1 in cardiac myocytes after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupAPPL1 mRNAAPPL1 proteinControl1.000.46±0.05LPS0.65±0.08?0.21±0.03?

*P<0.05vscontrol group.

2 APPL1重組慢病毒提高LPS條件下心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

APPL1重組慢病毒轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)LPS處理后，細(xì)胞中的APPL1 mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

Figure 2. Western blot was used to detect the effect of lentiviral overexpression of APPL1 on the expression of APPL1 in cardiac myocytes under LPS condition.

圖2 Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)APPL1慢病毒對(duì)LPS條件下心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)影響

表2 過(guò)表達(dá)APPL1慢病毒感染后經(jīng)LPS處理后的心肌細(xì)胞中APPL1表達(dá)水平

Table 2. APPL1 expression level in cardiomyocytes treated with LPS after APPL1 overexpression lentivirus infection(Mean±SD.n=3)

GroupAPPL1 mRNAAPPL1 proteinLPS1.000.25±0.03Lv-NC1.04±0.090.24±0.06Lv-APPL12.54±0.18?0.39±0.04?

*P<0.05vsLPS group.

3 過(guò)表達(dá)APPL1提高LPS條件下心肌細(xì)胞活力并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡

LPS處理后的心肌細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。過(guò)表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

Figure 3. Overexpression of APPL1 reduced LPS-induced cardiomyocyte apoptosis. A: flow cytometry was used to detect the effect of overexpression of APPL1 on LPS-induced cardiomyocyte apoptosis； B: effect of overexpression of APPL1 on the level of apoptotic protein cleaved caspase-3 in LPS-induced cardiomyocytes detected by Western blot.

圖3 過(guò)表達(dá)APPL1減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

4 過(guò)表達(dá)APPL1減輕LPS條件下心肌細(xì)胞氧化損傷

LPS處理后的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性升高，同時(shí)細(xì)胞中MDA含量也升高。過(guò)表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性降低，細(xì)胞中MDA水平也降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

5 過(guò)表達(dá)APPL1提高LPS條件下心肌細(xì)胞中抗氧化酶活性并降低細(xì)胞中ROS水平

LPS處理后的心肌細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性降低，細(xì)胞中ROS水平升高。過(guò)表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性升高，細(xì)胞中ROS水平降低(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表3 過(guò)表達(dá)APPL1的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后細(xì)胞活力、凋亡率及細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白水平

Table 3. Cell viability, apoptosis rate and cleaved caspase-3 protein level of cardiomyocytes with APPL1 overexpression after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)Apoptosis rate (%)Cleaved caspase-3Control100.005.63±0.570.21±0.03LPS63.32±7.51&32.26±3.89&0.68±0.08&Lv-NC65.21±8.2030.59±4.620.65±0.06Lv-APPL179.69±5.16?21.40±1.34?0.31±0.04?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

表4 過(guò)表達(dá)APPL1的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后細(xì)胞中MDA含量及培養(yǎng)液中LDH活性

Table 4. The content of MDA and the activity of LDH in the culture medium of APPL1-overexpressing cardiomyocytes after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupLDH (U/L)MDA (μmol/g)Control4.20±0.369.37±0.85LPS35.27±4.69&28.54±3.14&Lv-NC36.20±4.9526.81±3.59Lv-APPL118.26±1.18?16.55±1.27?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

表5 過(guò)表達(dá)APPL1的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS處理后細(xì)胞中ROS含量及SOD和GSH-Px活性

Table 5. ROS content and SOD and GSH-Px activity in cardiomyocytes with APPL1 overexpression after LPS treatment (Mean±SD.n=3)

GroupSOD (×103 U/g)GSH-Px (U/g)ROS (fluorescence intensity)Control89.47±9.32816.45±58.2617.48±1.64LPS41.56±4.59&412.20±40.76&89.52±7.63&Lv-NC40.20±3.12408.59±45.1790.58±6.20Lv-APPL164.17±3.79?597.12±50.92?45.01±3.57?

*P<0.05vsLPS and Lv-NC group；&P<0.05vscontrol group.

討 論

LPS是感染性內(nèi)毒素血癥心力衰竭發(fā)生的重要原因，LPS存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜上，是革蘭氏陰性菌致病發(fā)生的因素[8]。LPS能夠誘導(dǎo)心肌損傷，促進(jìn)心肌細(xì)胞氧化損傷，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS處理后的心肌細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率升高，同時(shí)細(xì)胞中凋亡標(biāo)志蛋白活化的caspase-3水平升高，細(xì)胞中ROS水平也升高，說(shuō)明成功構(gòu)建了LPS心肌細(xì)胞損傷模型。

APPL1蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)且具有高親水性，含有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，參與轉(zhuǎn)錄抑制、小GTP酶結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白質(zhì)結(jié)合、增加BAR與GTP酶的結(jié)合和BAR結(jié)構(gòu)域脂質(zhì)特異性發(fā)揮過(guò)程[10-14]。APPL1在骨骼肌、腎臟等多種組織中均可表達(dá)，參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)元存活和神經(jīng)突起形成等過(guò)程[15-16]。近年研究顯示，APPL1具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，在心肌缺氧復(fù)氧損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，沉默APPL1基因可以逆轉(zhuǎn)球狀脂聯(lián)素對(duì)心肌纖維化的抑制作用，另外，APPL1還參與心力衰竭和糖尿病心肌病損傷過(guò)程[6, 7, 17-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS降低心肌細(xì)胞中APPL1的表達(dá)，過(guò)表達(dá)APPL1可以抑制LPS對(duì)心肌細(xì)胞凋亡促進(jìn)和活力抑制作用，這說(shuō)明APPL1能夠減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，這與上述研究報(bào)道結(jié)果類似。

心肌細(xì)胞氧化損傷存在于多種原因誘導(dǎo)的心肌損傷中，例如：糖尿病心肌病、心肌肥大、動(dòng)脈粥樣硬化和膿毒癥心肌損傷等[19-20]。氧自由基能夠被機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶降解，從而使機(jī)體內(nèi)氧自由基處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[21]。SOD和GSH-Px是存在于人體組織中的抗氧化酶，二者活性降低后是細(xì)胞氧化損傷發(fā)生的標(biāo)志[22]。細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的氧自由基可以引起存在于細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性受到破壞，使存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放至細(xì)胞外，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物。另外，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)caspase凋亡反應(yīng)激活，促進(jìn)下游凋亡執(zhí)行因子caspase-3的活化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[23-24]。本實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)APPL1后的心肌細(xì)胞中ROS水平降低，細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性升高，細(xì)胞生成的MDA水平也降低，細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液中LDH水平降低，細(xì)胞中活化的caspase-3蛋白水平降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)APPL1可以減輕LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，提高心肌細(xì)胞中抗氧化酶活性，減少細(xì)胞凋亡，表明APPL1可能通過(guò)減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，APPL1在心肌組織損傷中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，APPL1參與LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)生，過(guò)表達(dá)APPL1可以減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷和凋亡，這對(duì)于研究APPL1在心血管系統(tǒng)疾病中的作用具有意義，為研究感染誘導(dǎo)的心肌損傷發(fā)生機(jī)制提供了參考。另外，本次實(shí)驗(yàn)研究沒(méi)有在原代心肌細(xì)胞和體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于其具體的靶向作用機(jī)制仍不清楚，在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)上述部分內(nèi)容進(jìn)行探討。