郭旭雪， 聶漢祥， 陳千慧， 鄧霓姍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 湖北 武漢 430060)

恒定自然殺傷T細(xì)胞(invariant natural killer T-cells，iNKT細(xì)胞)是一類獨(dú)特的T淋巴細(xì)胞亞群，活化的iNKT細(xì)胞產(chǎn)生Th2和Th1細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4和干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，因此被認(rèn)為是一種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞[1]。我們的初步研究表明iNKT細(xì)胞可以增強(qiáng)卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的哮喘小鼠過(guò)敏性氣道炎癥[2]，但具體機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是哮喘發(fā)生的始動(dòng)者，可以誘導(dǎo)CD4+Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，并在維持哮喘Th2反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)下，樹突狀細(xì)胞數(shù)量有限，因此經(jīng)常以髓源性樹突狀細(xì)胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)探討樹突狀細(xì)胞的表型和功能特征[4]。本實(shí)驗(yàn)首先分選OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠脾臟iNKT細(xì)胞，檢測(cè)iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA與BMDCs共培養(yǎng)后BMDCs表面分子和分泌細(xì)胞因子的表達(dá)水平；同時(shí)分選共培養(yǎng)后的BMDCs，檢測(cè)其與DO11.10轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ的水平，探討iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA對(duì)髓源性樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

6周齡健康雌性野生型BALB/c小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6周齡健康雌性DO11.10 OVA特異性MHC II限制性TCR轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，均在無(wú)特定病原體(specific-pathogen-free，SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。卵清蛋白(Grade V)和脂多糖(lipopolysacchride，LPS)購(gòu)于Sigma；免疫佐劑氫氧化鋁凝膠購(gòu)自Thermo；親和素連接的辣根過(guò)氧化物酶，PE-Cy5標(biāo)記的TCR-β抗體和同型陰性對(duì)照，PE-Cy5標(biāo)記的F4/80抗體，APC-Cy7標(biāo)記的CD11c抗體，PE標(biāo)記的MHC II 、CD80、CD86和CD40抗體，鏈霉親和素連接的PE及ELISA試劑盒(IL-12 p70、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-4和IFN-γ)均購(gòu)自eBioscicence；CD1d磁珠、CD11c磁珠和CD4+T細(xì)胞分離試劑盒均購(gòu)自Miltenyi；PE標(biāo)記的未負(fù)載的小鼠CD1d四聚體和PE標(biāo)記的PBS-57/小鼠CD1d四聚體由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)贈(zèng)送。

2 方法

2.1小鼠哮喘模型的制備與脾iNKT細(xì)胞的分選 野生型BALB/c小鼠[體重 (20±1) g]于第0和14天腹腔注射OVA 20 μg (含氫氧化鋁佐劑2 mg)，第25、26和27天腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，以O(shè)VA 100 μg滴鼻激發(fā)。末次激發(fā)24 h后取哮喘小鼠脾臟，用玻片碾磨，以50 μm尼龍膜過(guò)濾，離心后棄上清，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗2遍后得到脾單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells, MNCs)混懸液。采用免疫磁珠2步法分選獲得iNKT細(xì)胞，參考試劑說(shuō)明書操作。簡(jiǎn)要過(guò)程如下，首先向脾MNCs懸液中加入抗CD45R(B220)磁珠，通過(guò)MACS分選器陰性選擇去除細(xì)胞懸液中的B細(xì)胞；然后將陰性選擇得到的細(xì)胞 PE-PBS57/mCD1d四聚體，加入抗PE磁珠，通過(guò)MACS分選器進(jìn)行陽(yáng)性選擇獲得iNKT細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾iNKT細(xì)胞(PBS57/mCD1d四聚體+TCR-β+細(xì)胞)的純度。

2.2BMDCs的制備 髓源性樹突狀細(xì)胞的制備參考文獻(xiàn)[4]，首先將野生型BALB/c小鼠以頸椎脫臼法處死，在無(wú)菌環(huán)境下分離小鼠股骨和脛骨，沖洗骨髓腔，收集骨髓至離心管，離心后棄上清，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，無(wú)血清RPMI-1640洗滌2次后獲得小鼠骨髓細(xì)胞。隨后使用6孔培養(yǎng)板，采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基，內(nèi)含有10%熱滅活FBS、10 μg/L rmGM-CSF和10 μg/L rmIL-4，每孔加入4 mL 骨髓細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度 109/L)，置37 ℃，含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，強(qiáng)力吹打收集貼壁BMDCs，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMDCs(CD11c+細(xì)胞)的純度。

2.3哮喘小鼠脾iNKT細(xì)胞與BMDCs體外共培養(yǎng) 用含10%熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、50 μmol/L巰基乙醇、25 mg/L慶大霉素和5×104U/L青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于96孔板中，每孔含BMDCs 2×105個(gè)，分別與哮喘小鼠脾iNKT細(xì)胞(每孔 4×105個(gè))聯(lián)合100 mg/L OVA (iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組)、50 mg/L LPS (LPS組)、iNKT細(xì)胞(每孔 4×105個(gè))聯(lián)合PBS(iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組)、100 mg/L OVA (OVA組)或PBS(PBS組)在體外培養(yǎng)20 h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，分別用于檢測(cè)BMDCs表面分子和細(xì)胞因子水平。

2.4BMDCs表面分子和分泌細(xì)胞因子表達(dá)水平的檢測(cè) 首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組共培養(yǎng)后的BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40的表達(dá)水平。樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)CD11c分子，不表達(dá)F4/80分子，因此以CD11c+F4/80-細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞[5]。取各組培養(yǎng)懸液于離心管中，離心后分離上清液，加入抗小鼠CD16/CD32抗體，4 ℃，避光孵育30 min。分別加入APC-Cy7標(biāo)記的CD11c抗體和PE-Cy5標(biāo)記的F4/80抗體，分別向?qū)φ展苤屑尤胂鄳?yīng)的同型陰性對(duì)照，4 ℃ 避光 30 min，隨后分別加入PE標(biāo)記的MHC-II、CD80、CD86、CD40抗體或相應(yīng)的同型陰性對(duì)照，4 ℃ 避光 30 min，PBS液洗滌2次，重懸細(xì)胞到0.5 mL PBS中，上機(jī)檢測(cè)。隨后采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液IL-12p 70、IL-6、TNF-α和IL-10的水平，檢測(cè)方法參考試劑盒說(shuō)明書。

2.5DO11.10 CD4+CD25-T細(xì)胞的分選及與各組BMDCs體外共培養(yǎng) 為了進(jìn)一步探討與iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA共培養(yǎng)的BMDCs的功能，分選DO11.10 OVA特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠脾CD4+T細(xì)胞，與共培養(yǎng)后的BMDCs體外共培養(yǎng)。首先取6周齡DO11.10轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟，用玻片碾磨，以50 μm尼龍膜過(guò)濾，離心后棄上清液，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌2次后獲得脾MNCs混懸液。使用CD4+T細(xì)胞分離試劑盒，以磁珠分選法分選DO11.10 CD4+T細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作；參考試劑說(shuō)明書采用CD11c磁珠分選各組共培養(yǎng)后的CD11c+細(xì)胞，即為樹突狀細(xì)胞。用含有10%熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、50 μmol/L巰基乙醇、25 mg/L慶大霉素和5×104U/L青霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于96孔板中，每孔含DO11.10 CD4+T細(xì)胞2×106個(gè)和OVA(100 mg/L)，分別與各組分選的CD11c+DCs(2×105個(gè))在體外培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液，用于檢測(cè)IL-4和IFN-γ的水平。為排除各組BMDCs對(duì)其與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ水平的干擾，以RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞于96孔板中，每孔含各組分選的CD11c+DCs 2×105個(gè)和OVA(100 mg/L)，體外培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清液，用于檢測(cè)IL-4和IFN-γ的水平。

2.6DO11.10 CD4+CD25-T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)DO11.10 CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液和各組共培養(yǎng)后BMDCs培養(yǎng)(無(wú)DO11.10 CD4+T細(xì)胞)上清液IL-4和IFN-γ的水平，檢測(cè)方法參考試劑盒說(shuō)明書。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 髓源性樹突狀細(xì)胞和哮喘小鼠脾iNKT細(xì)胞的純度檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫磁珠法分選的哮喘小鼠脾iNKT細(xì)胞(PBS57/mCD1d四聚體+TCR-β+細(xì)胞)純度，純度達(dá)94.9%，見圖1A；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)野生型小鼠BMDCs(CD11c+細(xì)胞)的純度達(dá)94.5%，見圖1B。

Figure 1. The purity of the splenic iNKT cells from OVA-induced asthmatic mice (A) and the bone marrow-derived dendritic cells from na?ve WT BALB/c mice (B).

圖1 分選哮喘小鼠脾iNKT細(xì)胞和髓源性樹突狀細(xì)胞的流式純度圖

2 各組共培養(yǎng)后BMDCs表面分子表達(dá)水平的比較

以MHC-II+、CD80+、CD86+和CD40+BMDCs占BMDCs百分比表示BMDCs表型成熟水平[6]。iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40表達(dá)水平與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，但明顯高于iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組(P<0.05或P<0.01)，見圖2和表1。

Figure 2. The expression of MHC II, CD80, CD86 and CD40 on BMDCs (CD11c+F4/80-cells) from different BMDC specimens. BMDCs： bone marrow-derived dendritic cells. The percentages on the horizontal lines represent percentages of MHC-II+, CD40+, CD86+and CD80+BMDCs in BMDCs.

圖2 各組共培養(yǎng)后BMDCs表面分子表達(dá)水平的比較

表1 各組共培養(yǎng)后BMDCs表面分子表達(dá)水平的比較

Table 1. The expression of MHC-II, CD80, CD86 and CD40 on BMDCs (CD11c+F4/80-cells) in different BMDC specimens (%. Mean±SD.n=6)

GroupMHC-II+/BMDCsCD80+/BMDCsCD86+/BMDCsCD40+/BMDCsPBS62.6±15.831.9±7.723.2±4.141.0±11.6OVA63.6±16.530.7±7.522.9±4.838.4±10.2LPS94.2±20.1△△??88.8±18.6△△??93.2±21.5△△??89.6±18.3△△??iNKT cells plus PBS80.3±19.4△△62.6±14.5△△74.2±16.7△△59.4±12.8△△iNKT cells plus OVA90.3±21.2△△?85.5±19.2△△??88.4±20.5△△??82.3±20.1△△??

BMDCs: bone marrow-derived dendritic cells.△△P<0.01vsPBS and OVA group;*P<0.05,**P<0.01vsiNKT cells plus PBS group.

3 各組BMDCs共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平的比較

以BMDCs體外培養(yǎng)上清液IL-12 p70、IL-6、TNF-α和IL-10的水平表示BMDCs處于功能成熟水平[6]。iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組BMDCs培養(yǎng)上清液的IL-12 p70、IL-6和TNF-α水平與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，但明顯高于iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組(P<0.01)，見表2。iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組BMDCs培養(yǎng)上清液IL-10水平明顯高于iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組和LPS組(P<0.01)，見表2。

4 各組BMDCs與DO11.10 CD4+ T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平的比較

以BMDCs與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ水平表示iNKT細(xì)胞對(duì)BMDCs誘導(dǎo)CD4+Th0細(xì)胞分化的影響。iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組BMDCs與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液IL-4水平與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，但明顯高于iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組(P<0.01)，見表3。iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組BMDCs與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液IFN-γ表達(dá)水平與LPS組、iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組、OVA組和PBS組比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表3。iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組、iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組、LPS組、OVA組和PBS組BMDCs培養(yǎng)上清液均未檢測(cè)到IL-4和IFN-γ。

表2 各組BMDCs共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平的比較

Table 2. The levels of IL-12 p70, TNF-α, IL-6 and IL-10 in culture supernatants from different BMDC specimens (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupIL-12 p70TNF-αIL-6IL-10PBS0000OVA0000LPS730.5±182.4△△??4 227.4±872.0△△??4 399.5±978.4△△??1 198.4±261.7△△??iNKT cells plus PBS412.3±101.3??1 096.8±271.5??921.6±231.0??3 672.1±878.5??iNKT cells plus OVA694.7±168.7△△??4 016.1±868.4△△??4 411.8±983.5△△??1 032.8±250.2△△??

BMDCs: bone marrow-derived dendritic cells.**P<0.01vsPBS and OVA group;△△P<0.01vsiNKT cells plus PBS group.

表3 各組BMDCs與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平的比較

Table 3. The concentrations of IL-4 and IFN-γ in culture supernatants from DO11.10 CD4+T cells co-cultured with different BMDC specimens (ng/L. Mean±SD.n=6)

GroupIL-4IFN-γPBS25.7±6.28.6±1.9OVA25.1±5.68.5±1.6LPS89.8±22.3△13.1±3.0iNKT cells plus PBS27.0±6.98.1±2.0iNKT cells plus OVA86.5±21.5△12.6±3.1

BMDCs: bone marrow-derived dendritic cells.△P<0.01vsiNKT cells plus PBS group.

討 論

iNKT細(xì)胞是一群獨(dú)特的天然淋巴細(xì)胞亞群，通過(guò)分泌Th1和Th2細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)控功能，在固有免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)之間起重要的橋接作用[1]。我們的初步研究顯示iNKT細(xì)胞可以增強(qiáng)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠過(guò)敏性氣道炎癥[2]，但具體機(jī)制尚不清楚。樹突狀細(xì)胞是啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，在哮喘Th2反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。根據(jù)表型和功能成熟水平，樹突狀細(xì)胞分為不成熟和成熟樹突狀細(xì)胞[6-7]。樹突狀細(xì)胞表型成熟與其CD80、CD86和CD40等共刺激分子及MHC-II表面分子表達(dá)水平有關(guān)，而功能成熟與其分泌細(xì)胞因子水平和類型有關(guān)。成熟樹突狀細(xì)胞高表達(dá)MHC-II分子以及CD80、CD86和CD40等共刺激分子，產(chǎn)生IL-12、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子，而免疫負(fù)相調(diào)節(jié)因子如IL-10分泌水平下降；成熟樹突狀細(xì)胞可以誘導(dǎo)原始T細(xì)胞增殖分化,因此，成熟樹突狀細(xì)胞被認(rèn)為是免疫原性樹突狀細(xì)胞[6]。與之相反，不成熟樹突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)水平低，不產(chǎn)生或產(chǎn)生少量促炎細(xì)胞因子；不成熟樹突狀細(xì)胞可以誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能。因此，不成熟樹突狀細(xì)胞被認(rèn)為是耐受原性樹突狀細(xì)胞[6]。機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)下，樹突狀細(xì)胞數(shù)量有限，因此實(shí)驗(yàn)研究中經(jīng)常通過(guò)體外誘導(dǎo)小鼠骨髓原代細(xì)胞分化獲得髓源性樹突狀細(xì)胞并進(jìn)行其功能和表型研究[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)與哮喘小鼠iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA共培養(yǎng)的BMDCs表面分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平及共培養(yǎng)后的BMDCs與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IL-4和IFN-γ的分泌水平來(lái)探討iNKT細(xì)胞對(duì)樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在OVA時(shí)，iNKT細(xì)胞可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細(xì)胞表型和功能的免疫原性成熟。

本研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠BMDCs與PBS共培養(yǎng)后BMDCs低表達(dá)MHC-II、CD80、CD86和CD40等表面分子，培養(yǎng)上清液未檢測(cè)到IL-12 p70、IL-6、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子；同時(shí)分選與PBS共培養(yǎng)的BMDCs，與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ水平低下，因此體外誘導(dǎo)的髓源性樹突狀細(xì)胞為不成熟樹突狀細(xì)胞，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[8-9]。本研究將脂多糖與髓源性樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，觀察發(fā)現(xiàn)LPS組BMDCs高表達(dá)表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40，培養(yǎng)上清液中IL-12 p70、IL-6和TNF-α分泌水平升高，與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液IL-4水平增加，提示脂多糖可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細(xì)胞表型和功能免疫原性成熟。Xu等[10]以脂多糖(1 mg/L)或磷酸鹽緩沖液刺激髓源性樹突狀細(xì)胞12 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激的髓源性樹突狀細(xì)胞其表面分子CD80和CD86及培養(yǎng)上清液IL-12 p70、IL-6和TNF-α水平明顯高于磷酸鹽緩沖液刺激的髓源性樹突狀細(xì)胞，證明脂多糖可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細(xì)胞免疫原性成熟，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組BMDCs表面分子MHC-II、CD80、CD86和CD40及培養(yǎng)上清液IL-12 p70、IL-6和TNF-α水平與LPS組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液IL-4水平與LPS組比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA共培養(yǎng)的髓源性樹突狀細(xì)胞表型和功能免疫原性成熟。研究中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組BMDCs表面分子表達(dá)水平低于iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組和LPS組，但高于OVA組、PBS組，同時(shí)培養(yǎng)上清液促炎細(xì)胞因子水平低而IL-10分泌水平升高；與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，抑制其產(chǎn)生細(xì)胞因子，提示iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS共培養(yǎng)的髓源性樹突狀細(xì)胞耐受性成熟。本研究為排除各組髓源性樹突狀細(xì)胞對(duì)其與DO11.10 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ表達(dá)水平的干擾，分別檢測(cè)各組BMDCs培養(yǎng)上清液IL-4和IFN-γ的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA組、iNKT細(xì)胞聯(lián)合PBS組、LPS組、OVA組和PBS組BMDCs培養(yǎng)上清液均未檢測(cè)到IL-4和IFN-γ。

綜上所述，存在OVA時(shí)，iNKT細(xì)胞可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細(xì)胞表型和功能免疫原性成熟，而缺乏OVA時(shí)，iNKT細(xì)胞誘導(dǎo)髓源性樹突狀細(xì)胞耐受原性成熟。Caielli等[11]研究發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞在存在或不存在“危險(xiǎn)因素”時(shí)，可以通過(guò)激活樹突狀細(xì)胞的不同分子信號(hào)誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞免疫原性或耐受原性成熟，從而產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng)，因此iNKT細(xì)胞存在功能可塑性。

CD40-CD40L相互作用在樹突狀細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。Caielli 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，iNKT 細(xì)胞在TLR4刺激下與未成熟樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)，可以通過(guò)CD40-CD40L相互作用及NF-κB活化誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞免疫原性成熟。因此，iNKT 細(xì)胞可能通過(guò)CD40-CD40L途徑誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化成熟。但iNKT細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的具體相互作用機(jī)制仍有待闡述。

本研究證明，iNKT細(xì)胞聯(lián)合OVA可以誘導(dǎo)髓源性樹突狀細(xì)胞表型和功能的免疫原性成熟。樹突狀細(xì)胞是專職的抗原提呈細(xì)胞，參與吸入性抗原的攝取、加工和提呈，在哮喘發(fā)病的始動(dòng)、維持階段均發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。因此，我們推測(cè)iNKT細(xì)胞可能通過(guò)誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞表型和功能的免疫原性成熟增強(qiáng)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠過(guò)敏性氣道炎癥，但需進(jìn)一步研究。