譚智文 段揚 朱立新（通訊作者）

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院脊柱外科 廣東 廣州 510280）

前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，它在男性患者中的致死率在全球范圍內(nèi)列第二位[1]。在我國，前列腺癌是70歲以上人群中病死率最高的泌尿系腫瘤，嚴(yán)重影響男性的健康[2]。骨轉(zhuǎn)移是晚期前列腺癌的標(biāo)志，而骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的相關(guān)并發(fā)癥是患者死亡的主要原因[3]。因此，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移在臨床治療中仍是個棘手的問題。在前列腺癌的進(jìn)展中，前列腺腫瘤微環(huán)境（prostate tumor microenvironment, TEM）扮演著重要的角色。實驗已揭示了TEM中的細(xì)胞能使腫瘤細(xì)胞惡性增強，而腫瘤細(xì)胞也能反過來使TEM的惡性表型增加[4]。TEM主要由細(xì)胞外基質(zhì)和一些非惡性的基質(zhì)細(xì)胞組成。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是其中一類異質(zhì)性較大的細(xì)胞群體，CAFs是基質(zhì)改變的關(guān)鍵因子，能促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[5]。骨轉(zhuǎn)移的病變是由于骨形成和骨破壞的平衡被打破，因此破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞都參與了這個過程。近年來已有研究表明在腫瘤骨轉(zhuǎn)移中破骨細(xì)胞的活性發(fā)揮著重要的作用[6]。而miR-214-3p的表達(dá)與破骨細(xì)胞的活性密切相關(guān)[7]。目前國內(nèi)外的研究主要集中在前列腺癌細(xì)胞對破骨細(xì)胞的影響上，此前有研究人員提出前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液能促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[8]。而有關(guān)前列腺CAFs對破骨細(xì)胞作用的研究則比較少。我們在本研究中分離鑒定了前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs，并觀察它們對破骨細(xì)胞形態(tài)和活性等方面的影響。

1.資料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640（Gibco）；胎牛血清（Biological Industries）；雙抗（Gibco）；淋巴細(xì)胞分離液（Sigma）；M-CSF和RANKL（Sino Biological）；RNA提取并PCR試劑盒（Takara）；MTT（Beyotime）；抗PSA抗體、抗α-SMA抗體、抗Vimentin抗體（Abcam）；TRAP染色盒（Sigma）；引物購自上海生工公司。

1.2 前列腺癌組織來源

選擇于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院手術(shù)室進(jìn)行腹腔鏡下根治性前列腺癌切除術(shù)的3例患者，在術(shù)前未接受放化療。當(dāng)切除前列腺癌組織后，由病理科醫(yī)生選取避開壞死區(qū)的腫瘤組織，一半馬上作冰凍切片在顯微鏡下觀察，確定為癌組織或癌基質(zhì)組織后，另一半即用來提取前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs進(jìn)行原代培養(yǎng)。本研究通過南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會的審核，所有臨床標(biāo)本的獲取得到患者和家屬的知情同意。

1.3 方法

1.3.1 前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs的分離純化 用無菌剪刀將獲取的新鮮前列腺癌組織剪成1mm左右的小碎塊，用含0.2% Ⅳ型膠原酶和0.1%Ⅱ型膠原酶的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃中消化3 h，PBS洗滌2次，細(xì)胞沉淀吹散，用流式細(xì)胞術(shù)分選前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs。分別接種到培養(yǎng)皿上，使用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基在5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48h后換液，以后每3天換液一次，細(xì)胞密度達(dá)到80%時傳代，可得到純度較高的前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs。

1.3.2 前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs的鑒定 取培養(yǎng)好的細(xì)胞接種到細(xì)胞爬片上，再放到24孔板中。用4%多聚甲醇固定細(xì)胞10min，0.2% Triton X-100 通透細(xì)胞10min。接著用山羊血清封閉30min，分別用兔抗人前列腺癌特異抗原（PSA）孵育前列腺癌細(xì)胞，用兔抗人波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）孵育前列腺CAFs，3個一抗的濃度都是1:100，在4℃下過夜。羊抗兔二抗室溫避光孵育30min。最后用DAPI染核，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡觀察。

1.3.3 破骨細(xì)胞誘導(dǎo) 用含肝素的離心管取健康成年男性的外周血，用PBS按1:1稀釋后，輕柔加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫400g離心30min，中間的白膜層小心吸出，用PBS洗2次，即為單個核細(xì)胞。使用預(yù)先用CD14抗體包被的磁珠加入細(xì)胞中，室溫震蕩反應(yīng)30分鐘，置于磁力架上進(jìn)行磁分離。棄去上清，用PBS洗3次。

得到的CD14陽性細(xì)胞含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基在5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后加入30ng/ml M-CSF，48h后再加入50ng/ml RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)。

1.3.4 前列腺癌細(xì)胞、前列腺CAFs與破骨細(xì)胞共培養(yǎng) 本實驗采用transwell小室進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)。對照組為破骨細(xì)胞單獨培養(yǎng)，實驗組為前列腺癌細(xì)胞或前列腺CAFs與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)。破骨細(xì)胞接種在transwell 6孔板的下層，前列腺癌細(xì)胞或前列腺CAFs接種在小室上層。每2天換液，在培養(yǎng)達(dá)1，3，5d時取破骨細(xì)胞行MTT和PCR實驗，在第7d時取破骨細(xì)胞行TRAP染色。

1.3.5 TRAP 染色 共培養(yǎng)7d時，使用TRAP染色盒對破骨細(xì)胞進(jìn)行染色。首先用固定液在室溫下固定細(xì)胞30s，超純水洗凈后，按說明書配制好染色液，加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃避光孵育1h，再用超純水洗凈，即可在顯微鏡下觀察。細(xì)胞核多于3個的TRAP陽性細(xì)胞便為破骨細(xì)胞。

1.3.6 MTT檢測細(xì)胞活性 在共培養(yǎng)1、3、5d用胰酶消化收集三組細(xì)胞，加入96孔板中，細(xì)胞濃度為2000個/孔。每組設(shè)置5個復(fù)孔，2個空白對照孔，分別于24、48、72h，每孔加入10 μL MTT（5 mg/ml）溶液，37℃避光孵育4h。每孔再加入100μL二甲基亞砜（DMSO），室溫震蕩10 min。酶標(biāo)儀測定各孔490nm的OD值。

1.3.7 qRT-PCR檢測miR-214表達(dá)水平 在共培養(yǎng)1、3、5d，使用Trizol裂解三組細(xì)胞，加入200μL氯仿，劇烈震蕩，靜置15min。4℃、10,000g離心15min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入異丙醇，混勻后靜置10min。4℃、10,000R離心10min，收集RNA沉淀。晾干后用DEPC水溶解。按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)。使用引物序列如下： U6-F：CTCGCTTCGGCAGCAC，U6-R：AACGCTTCACGAATTTGCGT，miR-214-3p-F:ACACTCCAGCTGGGACAGCAGGCACAGACAG，miRNA-qPCR-R:CTCAACTGGTGTCGTGGA。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0進(jìn)行雙側(cè)t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗均重復(fù)3遍。

2.結(jié)果

2.1 前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs表型鑒定

分離培養(yǎng)所得到的前列腺癌細(xì)胞PSA陽性表達(dá)（圖1），前列腺CAFs α-SMA和Vimentin陽性表達(dá)（圖2、3）。

圖1 前列腺癌細(xì)胞鑒定，PSA陽性表達(dá)Fig.1 Identification of prostate cancer cells

圖3 前列腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞鑒定，Vimentin陽性表達(dá)Fig.3 Identification of prostate cancer-associated fibroblasts

前列腺癌細(xì)胞和CAFs共培養(yǎng)對破骨細(xì)胞生長有不同程度的促進(jìn)作用，在第7天，通過TRAP染色可以觀察到，對照組TRAP陽性的多核細(xì)胞較少，大部分仍為單核細(xì)胞（圖4A）；而共培養(yǎng)組均可見較多的TRAP陽性多核細(xì)胞，與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中CAFs組的TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)目比前列腺癌細(xì)胞組的要更多，胞體也更大，分化情況更好（圖4B、C）。

圖4 共培養(yǎng)7d破骨細(xì)胞分化情況Fig.4 Osteoclast differentiation after 7d-co-culture with prostate cancer cells or prostate cancer-associated fibroblasts.

2.2 共培養(yǎng)對破骨細(xì)胞增殖活性的影響

共培養(yǎng)1d，細(xì)胞接種于96孔板24h和48h時，增殖活性無顯著差異；接種于96孔板72h后檢測，前列腺癌細(xì)胞組和前列腺CAFs組的增殖活性均明顯上升，且前列腺CAFs組上升更多(圖5A)。共培養(yǎng)3d，細(xì)胞接種于96孔板24 h時未見顯著差異，48h和72h時可見前列腺癌細(xì)胞組和前列腺CAFs組的增殖活性顯著上升，且前列腺CAFs組上升更多（圖5B）。共培養(yǎng)5d時，在接種于96孔板24、48、72h后前列腺癌細(xì)胞組和前列腺CAFs組的增殖活性稍有上升，但未達(dá)顯著差異（圖5C）。

圖5 共培養(yǎng)1,3,5d，MTT測定破骨細(xì)胞增殖情況Fig.5 MTT analysis of osteoclast actⅣity after co-culture with prostate cancer cells or prostate cancer-associated fibroblasts

2.3 共培養(yǎng)對破骨細(xì)胞miR-214-3p表達(dá)量的影響

共培養(yǎng)1d，前列腺癌細(xì)胞組和前列腺CAFs組的miR-214-3p表達(dá)均上升，其中前列腺癌細(xì)胞組差異顯著（圖6A）。共培養(yǎng)3和5d，前列腺癌細(xì)胞組和前列腺CAFs組的miR-214-3p表達(dá)均顯著上升（圖6B、C）。

圖6 共培養(yǎng)1,3,5d，qRT-PCR測定破骨細(xì)胞miR-214-3p表達(dá)情況Fig.6 qRT-PCR of miR-214-3p levels in osteoclasts after co-culture with prostate cancer cells or prostate cancer-associated fibroblasts

3.討論

前列腺癌轉(zhuǎn)移對骨組織有偏好性。骨轉(zhuǎn)移能導(dǎo)致一系列的并發(fā)癥，包括持續(xù)的骨痛、骨折、脊髓壓迫、甚至致殘。這些癥狀能極大地降低患者的生活質(zhì)量，臨床中一般把它們統(tǒng)稱為“骨相關(guān)事件”[6]。因此，了解前列腺癌對骨代謝的影響能對早期干預(yù)骨轉(zhuǎn)移起到重要的幫助。

在轉(zhuǎn)移階段，前列腺癌細(xì)胞通過刺激破骨細(xì)胞，增強骨吸收的能力來創(chuàng)造出腫瘤生長所需要的空間。在這溶骨的過程中，破骨細(xì)胞的活性達(dá)到最高，而患者的生存率則會大大減少[9]。目前的研究大多集中在前列腺癌實質(zhì)（上皮）細(xì)胞對破骨細(xì)胞的影響上，很少關(guān)注前列腺癌基質(zhì)細(xì)胞如前列腺CAFs對破骨細(xì)胞的影響。而我們在實驗中通過提取原代的前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs，與原代破骨細(xì)胞共培養(yǎng)，分別比較它們對破骨細(xì)胞分化的影響。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)歷了共培養(yǎng)后，無論在前列腺癌細(xì)胞組還是前列腺CAFs組，破骨細(xì)胞的分化和增殖活性有了不同程度的促進(jìn)，與對照組相比具有顯著意義。另外，在TRAP染色下，可見前列腺CAFs組的成熟破骨細(xì)胞數(shù)量更多，胞體更大，細(xì)胞融合情況更多。MTT法也顯示前列腺CAFs組的破骨細(xì)胞比前列腺癌組的具有更強的增殖活性。這些結(jié)果提示前列腺癌基質(zhì)細(xì)胞具有比前列腺癌實質(zhì)細(xì)胞更強的促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的能力。由于CAFs是腫瘤微環(huán)境里的一種重要細(xì)胞，它能夠分泌多種生長因子提升腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。比如，前列腺CAFs的培養(yǎng)液里就含有豐富的白介素6來使上皮細(xì)胞的遷移能力增強[10]。所以，我們的研究結(jié)果也從另一個側(cè)面揭示了前列腺CAFs對轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。

miR-214-3p骨代謝疾病密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人體乳癌骨轉(zhuǎn)移的組織中，破骨細(xì)胞內(nèi)的miR-214-3p表達(dá)顯著上升，而且骨吸收更加活躍。在裸鼠中敲除了miR-214-3p后，乳癌骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)展被抑制了，骨吸收也減少了。體外實驗表明高表達(dá)的miR-214-3p能極大地促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[7]?？梢?，miR-214-3p是破骨細(xì)胞內(nèi)一個重要的調(diào)控因子。我們在共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)前列腺癌組和前列腺CAFs組的破骨細(xì)胞miR-214-3p水平顯著升高，提示前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs很可能是通過調(diào)控miR-214-3p來促進(jìn)破骨細(xì)胞活性的。

鑒于破骨細(xì)胞在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的重要性，我們可以考慮把破骨細(xì)胞作為治療的靶點。臨床實驗已證實雙磷酸鹽、狄迪諾塞麥等抑制破骨細(xì)胞活性的藥物具有一定的抗腫瘤作用。另外，通過抑制破骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)，如組織蛋白酶K和整合素，也能起到拮抗骨轉(zhuǎn)移的作用[11]。目前很多科學(xué)家都把miRNA制劑當(dāng)作治療疾病的一種新手段，根據(jù)本研究結(jié)果，我們猜想能通過干擾miR-214-3p的水平來抑制破骨細(xì)胞的活性水平，從而延緩前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。但是由于我們現(xiàn)在對miR-214-3p調(diào)控破骨細(xì)胞分化的深層分子機制還未完全闡明，所以未來需要更多的研究去探索這一領(lǐng)域。

綜上所述，本研究分離純化并鑒定了前列腺癌細(xì)胞和前列腺CAFs，在共培養(yǎng)體系中檢測了破骨細(xì)胞的增殖活性，發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞能增強破骨細(xì)胞的增殖能力，提高破骨細(xì)胞內(nèi)的miR-214-3p水平，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化生長。我們在搜索文獻(xiàn)過程中還沒有發(fā)現(xiàn)有與破骨細(xì)胞相關(guān)的同類型的研究，因此本研究成果有望為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的形成機制提供新的信息。