于越乾 付希安 劉 紅 張福仁

汗孔角化癥(porokeratosis, PK)是一種少見的、與遺傳密切相關(guān)的慢性進行性角化不全疾病，臨床表現(xiàn)為環(huán)形皮損，中央萎縮凹陷，周圍有堤狀或疣狀角化增生。組織病理學特征性存在角質(zhì)樣板層，即角化不全柱。除Mibelli描述的經(jīng)典斑塊型汗孔角化癥外，還可以分為淺表播散型(DSP)、播散性淺表性光線型(DSAP)、掌跖泛發(fā)型(PPPD)、疣狀斑塊型(PM)、單側(cè)線狀型、炎癥角化型、點狀汗孔角化癥、丘疹型、顯著角化過度型以及混合型等多種類型[1]。PK好發(fā)于四肢、面頸、軀干及掌趾部位，僅局限于下肢的汗孔角化癥少見。本文報道1例僅局限于雙下肢的淺表播散型汗孔角化癥，我們通過全基因外顯子發(fā)現(xiàn)其MVK基因發(fā)生剪切位點突變，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 患者,男，63歲。因雙下肢泛發(fā)暗褐色皮疹伴癢16個月，于2018年8月24日來我院就診?；颊?6個月前雙足背出現(xiàn)散發(fā)的綠豆大淡紅色丘疹，皮損逐漸向上蔓延擴大，自覺瘙癢。在外院使用糖皮質(zhì)激素類藥物治療后皮損加重。患者既往體健，家族成員中無類似疾病患者(圖1)。皮膚科檢查：雙下肢見米粒大淡褐色扁平丘疹，丘疹中間部分可見凹陷，邊緣纖細如一圈黑線(圖2)，口腔黏膜及外陰部未見明顯損害。皮膚組織病理示：表皮角化過度、角化不全，在角蛋白凹陷處可見不全角化柱，真皮可見非特異性炎細胞浸潤(圖3)，結(jié)合臨床表現(xiàn)診斷為汗孔角化癥。診斷明確后，給予硅油乳膏外搽以及維甲酸軟膏封包，在取得患者的知情同意后，抽取患者外周血2 mL進行基因檢測。

1.2 材料準備 外周血DNA的提?。翰捎锰旄蚪MDNA試劑盒(天根生化科技有限公司)提取外周血基因組DNA，將DNA樣本濃度調(diào)至30 ng/μL。

1.3 實驗方法 對患者的外周血DNA進行全基因組外顯子測序。首先進行基因組DNA建庫和目標區(qū)域捕獲，PCR擴增后進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的樣品外顯子文庫按照標準程序在Illumina HiSeq測序平臺進行高通量、高深度測序，全基因組外顯子測序由艾吉泰康生物科技(北京)有限公司完成。得到的原始測序結(jié)果排除dbSNP151數(shù)據(jù)庫、1000Genome Project數(shù)據(jù)庫、HapMap Project數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫中存在的SNP位點，通過BWA軟件對序列進行比對，并優(yōu)先與已報道的PK相關(guān)基因比對。

根據(jù)二代測序結(jié)果，對篩選的位點進行Sanger測序驗證，設(shè)計引物序列MVK-F：TTGGGCTTTATGGCCTGTTGG，MVK-R：CAGTGTCGTGGGCTCCTCT，由華大基因公司合成。PCR擴增條件如下：Premix TaqTM6.5 μL，DNA樣本(標化為濃度30 mg/μL)0.7 μL，正反向引物共0.5 μL，雙蒸水5 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，90℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行 30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。純化后的DNA產(chǎn)物在ABI 3130XL基因遺傳分析儀(美國ABI公司)上進行測序。

2 結(jié)果

將原始二代測序結(jié)果進行dbSNP151數(shù)據(jù)庫、1000Genome Project數(shù)據(jù)庫、HapMap Project數(shù)據(jù)庫的篩選，結(jié)合之前報道的PK相關(guān)基因(PMVK, MVK, MVD, FDPS等),我們將DSP的致病基因鎖定為位于12號染色體的MVK基因。先證者在MVK基因10號內(nèi)含子存在一剪切位點突變，位于11號外顯子前兩個堿基(c.1040-2A>C)。進一步采用Sanger測序進行驗證，檢測到該位點后進行反向測序驗證，而100名正常對照中未檢測到該位點，測序結(jié)果如下(圖4)。查閱文獻，發(fā)現(xiàn)該位點既往曾在1例播散性淺表性光線型汗孔角化癥(DSAP)患者中報道過。使用SIFT和Polyphen工具對突變位點進行分析，得出數(shù)據(jù)分別為0和1，推測該剪切位點突變有害。

圖1先證者家系圖圖2右下肢見米粒大淡褐色扁平丘疹，丘疹中間部分可見凹陷，邊緣纖細如一圈黑線圖3表皮角化過度、角化不全，在角蛋白凹陷處可見不全角化柱，真皮可見非特異性炎細胞浸潤(HE，×100)

圖4Sanger測序驗證引物PCR擴增產(chǎn)物測序圖(正向及反向)，檢測到MVK基因發(fā)生c.1040-2A>C突變，為錯義突變

3 討論

PK由Vittorio Mibelli在1983年首次描述并命名，流行病學研究顯示PK好發(fā)于20～40歲，發(fā)病率隨年齡增加而增加，在男女之間發(fā)病率大致相同[2]。1937年Andrew首先發(fā)現(xiàn)DSP，將其歸類為PM的一個臨床亞型[3]。DSP為常染色體顯性遺傳，多在青少年發(fā)病，癥狀隨年齡增加而更加明顯。多發(fā)于顏面、頸、軀干、掌跖及四肢暴露部位，表現(xiàn)為大小不等的圓形、環(huán)形或不規(guī)則形淡褐色斑，邊緣有一纖細黑線，中央部分凹陷，紫外線不是本型的誘發(fā)因素[1]。

PK需同光化性角化病、脂溢性角化病、扁平苔蘚、萎縮性硬化性苔蘚、疣、疣狀表皮痣、Bowen病、線型銀屑病等相鑒別[4]。臨床上偶爾可見PK局限于某一部位。Joshi等[2]回顧27例局限于外生殖器及肛門臀部的PK，病變最常見的部位是陰囊、陰莖、臀部和鄰近的大腿，這些患者往往難以確診并且各種治療效果均欠佳。本例DSP患者皮損僅局限于雙下肢，身體其他部位未見皮損，目前國內(nèi)共報道3例局限于雙下肢的PK。鄒睛等[5]報道1例藏族患者局限于雙下肢淺表播散性角化性丘疹2年余；柏亞萍等[6]報道1例局限于左小腿疣狀斑塊型汗孔角化癥伴劇烈瘙癢；林盡染等[7]報道急性蕁麻疹后發(fā)生的發(fā)疹性丘疹型PK1例，該患者皮損局限于雙下肢2 周且無自覺癥狀。此外，單側(cè)線狀型PK發(fā)生在單側(cè)肢體。這表明不同臨床亞型PK都可以局限于某一部位。PK臨床差異較大，同一家系中不同患者的臨床表現(xiàn)可不同。先證者皮損局限于雙下肢，這可能由于環(huán)境因素及單核苷酸多態(tài)性等影響因素造成。

PK已被證明與多個基因突變有關(guān)。2012年Luan和Cao等[8，9]在中國患者中鑒定出了幾個DSAP的易感位點，并定位在16q24.1-24.3和12q21.2-24.21。2015年，Zhang等134例進行全基因組外顯子測序，發(fā)現(xiàn)3個新基因(PMVK, MVD, FDPS)發(fā)生突變[10]。有33%和16%的汗孔角化癥患者檢測到有MVK基因突變，體外功能研究提示MVK可以保護角質(zhì)形成細胞免受紫外線照射后的誘導(dǎo)凋亡[11，12]。目前已發(fā)現(xiàn)40多個致病突變位點，其中65.9%是錯義突變，大多數(shù)突變發(fā)生在外顯子10，表明它編碼一個熱點區(qū)域[13]。

MVK基因定位于染色體12q24，由10個編碼外顯子和1個非編碼外顯子組成，編碼產(chǎn)物為甲羥戊酸激酶7[14，15]。MVK基因突變可產(chǎn)生多種臨床亞型，即使攜帶同一突變位點也可能出現(xiàn)不同的臨床表型, 其中常見的有斑塊型PK、播散性淺表型PK、播散性淺表性光化型PK，有研究者發(fā)現(xiàn)MVK基因c.604G>A突變?yōu)镈SAP與PM的共同致病突變位點[16]。本例患者MVK基因發(fā)現(xiàn)剪切位點突變位于MVK基因第四個保守區(qū)域內(nèi)，此區(qū)域可能與角質(zhì)形成細胞的分化及紫外線導(dǎo)致的細胞凋亡有關(guān)。Parimi等[17]曾報道攜帶此位點的1例DSAP患者，c.1040-2A>C可以引起DSAP及DSP兩種臨床亞型。

在本研究中我們報道了1例僅局限于雙下肢的DSP，并通過全基因組外顯子測序方法發(fā)現(xiàn)一突變位點c.1040-2A>C，該突變位點可能可能與角質(zhì)形成細胞的分化及紫外線導(dǎo)致的細胞凋亡有關(guān)，為DSAP與DSP的共同突變位點，這為PK的遺傳致病基因?qū)W說提供了證據(jù)，也為將來的遺傳咨詢、基因診斷奠定了基礎(chǔ)。